水稻早衰突变体psl4(t)的表型鉴定及基因定位

水稻叶片早衰严重影响水稻的产量与品质,挖掘水稻叶片早衰相关基因并解析其分子机制,对提高水稻产量具有重要意义.从涪恢9802和LR杂交后代中筛选到叶早衰突变体psl4(t),该突变体6叶期前叶片呈正常绿色,从7叶期至剑叶(倒1叶)期每张叶片均是从叶尖至叶中部逐渐衰老,叶片的叶绿体发育受阻其体积变小、光合色素质量分数减少,叶片提前衰老.农艺性状分析结果表明:与野生型相比,突变体psl4(t)的穗长、有效分蘖数和籽粒宽变化无统计学意义,而株高、每穗粒数、结实率及千粒质量显著降低.遗传分析结果发现:突变体psl4(t)的早衰性状受单隐性核基因控制,利用分子标记将目标基因定位于第4染色体长臂端两个SSR标记(RM17004和RM17006)之间38.5 kb的范围内.研究为psl4(t)基因的克隆及功能解析、早衰分子机制研究奠定基础.

干旱条件下DCMU对高表达转C4-pepc水稻的花青素合成基因及其相关信号的影响

为了揭示高表达转玉米C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,EC 4.1.1.31)基因水稻(PC)在耐旱中光合与花青素调节途径的内在联系,本研究以PC和未转基因野生型原种(WT)的水培苗为试验材料,在4~5叶期,通过50μmol·L-1光合抑制剂DCMU[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea]预处理1 h,观察其在12%PEG-6000模拟干旱处理下的表现。结果表明,在模拟干旱条件下,DCMU预处理使两种供试材料相对含水量显著下降,且PC相对含量显著高于WT;干旱处理下,两种材料的花青素含量显著升高,DCMU和干旱处理使两种材料的花青素含量下调,且PC水稻中始终伴随着较高的花青素含量。光合数据表明,与单独12%PEG-6000处理相比,DCMU联合12%PEG-6000处理显著抑制了两种水稻材料的净光合速率、气孔导度、胞间CO2含量及羧化效率,但PC的各指标显著高于WT。同时,DCMU联合12%PEG-6000处理显著下调两种供试材料的内源蔗糖含量,但PC中蔗糖含量显著高于WT。进一步研究发现PC中更高的蔗糖含量与花青素合成有关转录因子b HLH(Os B1,Os B2)、R2R3-MYB(Os C1)、COP1(constitutively photomorphogenic 1)、HY5(elongated hypocotyl 5)更高的转录水平同步,下游花青素合成相关基因Os PAL、Os CHI、Os CHS、Os F3H、Os F3’H、Os DFR、Os ANS的表达量增加。PC水稻可能通过诱导NO和Ca2(10)感受干旱信号,参与转录因子的调节,进而参与花青素合成基因的调控,合成较多的花青素,增强PC水稻对干旱逆境的响应,增强保水能力,最终表现耐旱。

不同遗传背景对水稻sdr4突变体表型的影响

SDR4基因是借助QTL(quantitative trait loci)方法克隆的调控水稻种子休眠的关键基因。种子休眠性状是由多基因调控的。利用CRISPR/Cas9技术敲除日本晴品种和宜香1B品种的SDR4基因,发现前者突变体完全无休眠,种子活力差;而后者突变体的种子呈弱休眠,有一定比例的穗发芽,但未穗发芽的种子可耐受脱水干燥。此外,可以明显观察到宜香1B背景下sdr4突变体的胚胎体积增加、胚胎蛋白含量增多,为研究SDR4基因功能及其下游基因,甚至克隆SDR4互作基因提供了重要基础。

水稻多胺氧化酶基因(OsPAO4)CRISPR/Cas9编辑突变体的创制

【目的】稻瘟病是水稻生产上的重要限制因素,挖掘与利用抗病基因是实现水稻高产稳产的重要保障。前期研究发现,稻瘟病抗性相关osa-miR-21可能通过靶向调控多胺氧化酶基因OsPAO4调节水稻稻瘟病抗性,但目前多胺氧化酶(Polyamine oxidases,PAOs)在水稻抗病中的功能研究尚未见报道。为进一步探究其在水稻抗病中的可能生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对水稻OsPAO4基因进行定点编辑并对其后代突变体进行分析。【方法】在OsPAO4第2外显子处设计了1个20 bp的编辑靶点,将靶点核苷酸片段克隆至pRGEB32载体,获得OsPAO4编辑载体。随后,利用农杆菌介导法转化水稻Pik-H4 NIL愈伤组织中,经过再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T_(0)代植株靶位点附近DNA序列进行PCR和测序分析。【结果】OsPAO4基因被成功编辑,最终获得25个转基因阳性植株,并在T_(0)代产生多种突变类型:3株纯合突变、18株杂合突变和4株未发生编辑的植株。此外,T_(0)代杂合突变ospao4-8的颖壳颜色由紫色变为深灰色,且ospao4突变体中过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性有所升高,推测OsPAO4可能参与水稻的基础免疫过程。【结论】创制了多种类型ospao4突变体材料,初步确定OsPAO4可能参与水稻免疫过程的调控,为进一步深入揭示OsPAO4基因的具体生物学功能和分子调控机制奠定了重要基础。

5-氮杂胞苷对高表达转玉米C_(4)-PEPC基因水稻耐旱性的影响

为了揭示DNA甲基化在高表达转C4-PEPC基因水稻植株对干旱耐性的作用,以高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(C4-PEPC)水稻(PC)和受体Kitaake(WT)为材料,通过发芽、水培和盆栽试验,研究了施用不同浓度的DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)联合干旱处理下,水稻芽期、苗期和生育后期,种子发芽率,苗期叶片的相对含水量、丙二醛、脯氨酸、总可溶性糖及其组分及总可溶性蛋白含量、PEPC酶活性以及C4-PEPC、与蔗糖非发酵1(SNF1)相关蛋白激酶(SNF1-related protein kinase 1s,SnRK1s)基因以及甲基转移酶基因表达的变化、剑叶的光合参数,并最后考察产量构成因子的变化,结果表明:5-azaC对水稻芽期和苗期干旱胁迫作用浓度呈现剂量效应,即低浓度促进,而高浓度抑制,其中作用浓度:芽期<苗期;而对芽期和苗期有促进和抑制的2个浓度外施于水稻生育后期的水稻植株后,则出现恶化的效应,表现为矮化、剑叶的净光合速率和单株产量下降。在缓解干旱抑制的浓度下,PC苗期的缓解效果好于WT,这种差异的表现与其内源蔗糖、SnRK1s基因以及OsMET1b的表达差异同步,而且PC叶片C4-PEPC表达对不同浓度的5-azaC处理也呈现剂量效应。综上,DNA甲基化参与了水稻干旱响应,但不同生育期表现不同,其中糖信号在调节DNA甲基化增强PC干旱耐性起重要作用。

转C4型PEPC基因水稻非生物胁迫耐受性研究进展

作物在生长过程中会遇到很多非生物胁迫,如高温、高光强、干旱以及土壤盐碱化等,严重影响着作物产量潜力的发挥。水稻作为一半以上人类的主食以及模式植物,其对逆境信号分子的感受和响应作用机制一直是植物科学研究的热点之一。而高表达转玉米C 4型PEPC基因水稻显著增强了水稻的耐逆特性,作为表现耐逆优势的植物材料,在不同非生物胁迫有系列报道。文章对该水稻材料在形态、产量、生理生化及分子方面的变化特点以及其在响应非生物逆境下信号分子、转录因子、靶基因以及激素的作用机制等方面进行了总结,以期为进一步阐明水稻的耐旱机理提供参考依据。

水稻抗白叶枯病基因Xa-4的PCR标记研究

根据与水稻抗白叶枯病基因Ｘａ－４紧密连锁的分子标记Ｍ５５的序列设计引物，通过对国际水稻研究所育成的抗白叶枯病近等基因系和基因累加系的叶片ＤＮＡ、半粒种子提取物及Ｘａ－４基因的杂合体ＤＮＡ的ＰＣＲ特异扩增，初步建立了Ｘａ－４的ＰＣＲ标记体系。进而用该标记体系对我国籼型杂交水稻常用的亲本材料进行分析，揭示出了Ｘａ－４在这些材料中的分布情况。

C_4转基因水稻秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构特征

目的探明C4转基因水稻高光效的生物学结构基础。方法以已导入玉米C4光合关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)和PEPC+PPDK的转基因水稻为材料,以其受体品种Kitaake(WT)为对照,运用扫描电镜观察了秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构,运用透射电镜观察叶肉细胞。结果与对照品种相比,转C4单基因水稻叶片气孔密度提高、面积增大,PPDK气孔密度和气孔面积都居各转基因品系之首;转C4双聚合基因(PEPC+PPDK)水稻叶片气孔密度提高、面积减小;C4转基因水稻各品系叶片叶肉细胞中叶绿体基粒堆密集,有些基粒类囊体沿长轴方向排列整齐、完整;C4转基因品系的叶鞘均比对照品种粗壮坚韧;除PPDK外,所有转基因品系叶鞘的内外侧维管束及其导管管腔、筛管等执行物质运输功能的组织结构的面积均大于对照品种。结论C4转基因水稻叶片气孔多、面积大以及叶鞘维管束结构发达是C4转基因水稻高光效实现的结构前提和基础,与秧苗高的干物质积累相一致。

野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-4的分子标记定位

为了用分子标记准确定位野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf 4 ,将日本水稻基因组项目 (RiceGenomeProgram ,RGP)构建的水稻遗传连锁图谱第 10染色体分子遗传图上的分子标记R1877和G2 15 5之间对应区域YAC物理图上的 6个YAC克隆进行了亚克隆 ,获得 119个片段。对这些探针进行多态性探查 ,获得了 2个多态分子标记。用珍汕 97A和恢复基因近等基因系的杂种F2 分离群体中的 117完全不育株进行连锁分析表明 ,从YAC4 892获得的亚克隆Y3 8与Rf 4座位的连锁距离为 0 .9cM ,从YAC4 6 30获得的亚克隆Y1 10与Rf 4座位的连锁距离为3.2cM。根据以上结果把Rf 4座位定位于第 10染色体的特定位置 ,为该基因的分子标记辅助选择和定位克隆打下了基础。

水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的RNAi研究及表达分析

在图位克隆获得目的基因OsCSLD4的基础上,利用Invitrogen公司的Gateway系统将500bp的OsCSLD4基因cDNA编码序列以反向互补的方式插入pANDA35HK,构建了水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的干涉载体pANDAH05。利用农杆菌转化法将干涉载体pANDAH05及对照空载体pANDA35HK分别转化突变体原始亲本日本晴幼胚。转基因阳性植株表型观察结果显示:干涉载体pANDAH05转化日本晴幼胚后,T0代植株出现了类似于突变体1ah137的表型,叶片明显变窄,卷曲程度增加,株高降低;对照空载体pANDA35HK转化日本晴幼胚后,T0代植株仍保持野生型表型;Real-timePCR检测结果显示:日本晴转干涉载体pANDAH05后,目的基因表达量明显降低,干涉强度不同目的基因表达量降低程度不同,研究结果表明目的基因OsCSLD4在水稻叶片形态发育过程中起着非常重要的作用。

不同水稻基因型苗期NO_3^-吸收动力学特征及其受吸收液中NH_4^+的影响

采用水培方法研究了 12个水稻品种和 2个旱稻品种在苗期 (2 0d)的NO3 -吸收动力学特性及添加吸收液中NH4+ 对NO3 -吸收的影响。结果表明 ,NO3 -吸收的最大速率 (Vmax)为 :旱稻 >水稻 ,籼稻 >粳稻 ,杂交稻 >常规稻。NH4+ 对NO3 -吸收Vmax的影响在基因型间有较大差异 :籼稻受影响小于粳稻 ,杂交稻小于常规稻 ,旱稻基本不受影响。NH4+ 对个别籼稻和旱稻品种的NO3 -吸收甚至有促进作用。NH4+ 对所有供试水稻基因型NO3 -吸收的Km 值影响均很小 ,说明NH4+ 对NO3 -吸收的影响可能主要在于影响细胞膜上NO3 -载体的运转速率而非吸收位点与NO3

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区的分子变异

应用反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)和单链构象多态性 (single strandconformationpolymorphism ,SSCP)技术快速检测我国水稻条纹病毒 (RSV)RNA4基因间隔区 (intergenicregion ,IR)的分子变异 ,结果表明 ,我国RSVRNA4IR存在分子变异。供试的 7个分离物共有 4种泳动带型 ,其中YL、BS、JD、LY分离物完全一致 ,而SQ、PJ、JN各不相同。序列测定证实了PCR SSCP结果。各分离物RNA4IR序列均由 6 5 4个核苷酸组成 ,其中YL、BS、YL及JD 4个分离物序列完全一致 ;JN、PJ、SQ 3个分离物各不一样 ,序列之间的同源性均在 92 %～ 94%之间。IR序列内部具有两个重要的结构特征 :(1)有两处反向重复序列 ,可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大 ;(2 )具有插入序列 ,相对于日本M分离物 ,我国 7个分离物都有一段长 19bp的插入序列 ,这段插入序列比较保守 ,各分离物之间仅有 1～ 2个碱基的差异。

水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4功能标记的开发及其利用

通过分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)培育氮高效水稻品种是减少氮肥使用量、发展绿色农业和可持续农业的一个重要途经。水稻OsGRF4基因编码生长调节因子蛋白,编码区第487和488碱基由TC变异为AA,导致丝氨酸突变为赖氨酸,使得水稻具有氮高效利用、高产和耐冷的特性。为了提高OsGRF4基因在育种中的选择效率,本研究根据功能SNP(single nucleotide polymorphism)位点设计和筛选出等位基因特异PCR(polymerase chain reaction)功能标记PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。利用此功能标记对不同品种(品系)和川大粒/巨穗稻的F2群体进行基因型检测,结合测序分析验证,能准确快速鉴定OsGRF4的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型,且具有操作简单、成本低的特点。本研究开发的功能标记为通过MAS方法利用OsGRF4基因培育氮高效、高产和耐冷水稻新品种提供了技术支撑。

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区序列分析——混合侵染及基因组变异证据

克隆和测定了我国水稻条纹病毒 (RSV) 2 2个分离物RNA4基因间隔区 (Intergenicre gion,IR)序列 ,序列比较结果表明 ,我国RSVRNA4IR在长度上存在 63 4bp、65 4bp及 73 2bp 3种不同的类型 ,其中 3种不同类型的序列在云南省均有存在 ,而在其它省份仅存在 65 4bp类型的序列 ,云南省还存在不同片段类型序列在同一分离物中混合侵染的现象。序列内部具有两个重要的结构特征 ,一是具有插入序列 ;二是有两处反向重复序列 ,可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大。本论文还讨论了插入片段特性。

转C_4光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用

对pepc、ppdk和pepc +ppdk三种转基因水稻农艺性状观察表明 ,与原种Kitaake相比单株有效穗有不同程度的增多 ,单株产量相应提高 ,特别是pepc和ppdk基因聚合后 ,单株有效穗和单株产量分别比受体亲本Kitaake提高 2 9.1%和2 7.0 %。三种转基因材料作基因供体分别与受体光敏核不育系培矮 6 4S、2 30 4S和 2 30 6S杂交后 ,这些基因在新的遗传背景下不仅稳定遗传和高水平表达 ,而且表现增穗增产 ,特别当pepc和ppdk基因聚合时 ,与受体相比 ,F1的PEPC活性提高 5 .8～ 18.6倍 ,PPDK活性提高 0 .5～ 1.3倍 ,植株饱和光合速率提高 5 0 %左右。转育的转基因材料结实率有所降低 ,是值得进一步研究的问题。

转OsMAPK4基因水稻耐盐性分析

构建了由组成型启动子E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pCME12,利用农杆菌介导法转化黑龙江省主栽品种五优稻1号水稻愈伤组织,Southern杂交检测表明,OsMAPK4基因整合到水稻基因组上,获得了转基因水稻植株。对转基因水稻在种子发芽期和苗期进行了耐盐性分析,结果表明,转基因水稻种子在含0.2mol·L-1NaCl的培养基上能正常萌发;转基因水稻幼苗在0.4mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色,种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株栽至无盐土壤中,植株能萌发出新叶片。

ZmC_4Ppc基因水稻的标记辅助选择及其后代的产量性状分析

ZmC4Ppc基因全长6781bp,PCR扩增时带型不清晰,重复性差,影响标记辅助选择的准确性。通过序列比对找到了该基因在玉米上存在而在水稻上不存在的特异片段,利用Primer Premier5.0设计了1对用于水稻标记辅助选择的特异性引物(前引物为5′AAGCAGGGAAGCGAGACG3′,后引物为5′GATTGCCGCCAGCAGTAG3′,命名为MRpc)。结果表明,经MRpc筛选的该基因在各生育阶段都能高效表达,且为组成性表达。对标记辅助选择后代FPM881进行了遗传背景、PEPCase活性、净光合速率、一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA)分析。FPM881与对照的遗传背景相似度已达95%以上,ZmC_4Ppc在MAS的各世代中能够高效表达。GCA和SCA分析结果表明从FPM881中能够筛选出单株产量、有效穗和千粒重优于对照、GCA较高的改良恢复系并得到SCA显著高于对照的杂交组合。试验结果说明,ZmC4Ppc基因高效表达能提高经济产量,在水稻遗传背景中发挥其基因效应。

模拟干旱胁迫对转C_4双基因水稻幼苗光合功能及部分抗氧化酶活性的影响

为了探究转玉米C4双基因水稻抗旱性,以野生型恢复系水稻R299及其转PEPC&PPDK基因水稻恢复系纯合品种R2P为材料,木村B营养液培养至3叶1心。对两种水稻在20%浓度(质量体积比)PEG6000(聚乙二醇)模拟干旱条件下光合及相关生理生化指标的变化进行了比较。结果表明:在正常木村B营养液水培条件下,转基因株系R2P的叶绿体超微结构、光合及其相关生理指标与R299相比,未见明显差异;但在20%PEG6000模拟干旱条件下,两种水稻之间显示出了明显的变化,表现为R2P的光合速率、C4光合酶活性、SOD(超氧化物歧化酶)活性、Pro(游离脯氨酸)含量均显著高于R299,叶绿体超微结构较R299稳定,而MDA(丙二醛)含量、O2·-(超氧阴离子)产生速率显著低于R299。说明转C4双基因水稻抗旱性增强,光合及抗氧化系统在PEG6000模拟干旱条件下能保持相对较高的稳定性。

一个控制水稻籽粒长度主效基因——Lk-4(t)的BC_2F_2群体定位及其遗传效应分析(英文)

水稻籽粒大小和形状是影响稻米外观品质和产量的重要影响因素,对控制这些性状基因的定位和克隆有助于弄清 籽粒大小基因的表达模式和相应的代谢系统,最终实现该性状的自由调控。运用SSR和CAPs标记对来源于蜀恢527//蜀 恢527／小粒回交组合BC2F2群体800隐性长粒单株进行分析,定位了一个控制水稻籽粒长短的基因,Lk-4(t)。对F2和BC2F2 群体籽粒大小形状和千粒重的遗传分析表明,回交能将大部分对目的基因效应具有干扰修饰作用的微效基因多态性除去, 从而有利于对目的基因型的准确鉴定;在F2和BC2F2群体中只发现两类籽粒长短表现型,即短粒和长粒,并且二者分离比 例符合3:1的典型一对等位基因分离比例。这说明群体中籽粒长短变异是受一对基因控制。通过对BC2F2群体中隐性(长 粒)单株进行分子标记分析,将这个控制籽粒长短的主效基因定位在3个CAPs标记,P1-EcoRV,P2-Sac I和P3-Mbo I 附近。连锁分析表明,Lk-4(t)位于水稻第3染色体着丝粒附近,离标记P1-EcoRV和P2-Sac I分别有0．90 cM和0．50 cM 的距离。

高表达转 C4型 PEPC 基因水稻在低氮下诱导碳氮酶稳定光合作用

为揭示高表达转玉米C4-PEPC基因水稻在低氮条件下的光合表现,采用高表达转玉米C4-PEPC基因水稻(PC)与原种Kitaake(WT)为试验材料,通过盆栽试验,分别测定不同的氮素条件下(中氮300 kg/hm2,低氮65 kg/hm2),开花后不同天数的SPAD值,光合参数以及碳氮关键酶活性。并在开花后50 d收获植株,记录产量因子。结果表明:低氮处理下的PC相对于WT来说,在开花后14,28 d,其净光合速率分别提高了13.10%(P<0.05)和29.29%(P<0.05)。同时,Rubisco羧化酶在开花后14,28 d时活性分别提高了67.86%和52.63%(P<0.05);硝酸还原酶在14,28 d时的活性分别提高79.49%(P<0.05)和17.96%;谷氨酰胺合成酶仅在开花后28 d时活性提高28.48%(P<0.05)。但是通过对产量进行分析,在低氮条件下,并未发现PC的产量与WT有明显差异。可见,PC通过诱导碳氮的关键酶活性的提高维持低氮条件下高净光合速率。