黄芪甲苷基于ILT4-PI3K/Akt-B7-H3通路对NSCLC免疫逃逸机制影响的实验研究

目的:探究黄芪甲苷通过ILT4-PI3K/Akt-B7-H3通路抑制非小细胞肺癌(NSCLC)免疫逃逸的机制。方法:A549人肺腺癌细胞株,对细胞进行复苏、培养和传代。选取对数生长期细胞行MTT实验,细胞传代后用黄芪甲苷进行干预。根据药物浓度分为对照组及黄芪甲苷低、中、高浓度组,药物干预后进行Western blot实验、qRT-PCR实验、划痕实验、MTT试验。结果:各组D(λ)值随时间及黄芪甲苷浓度的增加而降低,40μmol/L以上各给药组间差异不明显。各浓度黄芪甲苷均能抑制A549细胞增殖,且抑制作用随药物浓度升高及时间延长而增强。黄芪甲苷低、中、高浓度组ILT4、PI3K、Akt蛋白表达显著低于对照组(P<0.05),低、中浓度组B7-H3蛋白表达显著低于对照组,ILT4、PI3K、Akt、B7-H3 mRNA表达显著低于对照组(P<0.05)。各组细胞划痕愈合率均随着时间的延长而提高,随着黄芪甲苷浓度的升高而降低(P<0.05)。结论:黄芪甲苷在蛋白水平和基因水平上均能显著降低A549细胞ILT4的表达,抑制PI3K/Akt通路,影响B7-H3的表达,抑制ILT4-PI3K/Akt-B7-H3通路,可进一步影响肺癌免疫逃逸的后续阶段,从而抑制NSCLC的发生发展。

补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织海马区CXCR4-PI3K生物学自噬轴的作用

目的探讨补阳还五汤对脑出血大鼠CXCR4-PI3K自噬轴的影响及其机制。方法健康SD雄性大鼠72只按照Rosenberg法复制脑出血大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组,每组各18只,补阳还五汤组、银杏叶片组分别采用补阳还五汤、银杏叶片灌胃,假手术组及模型组给予等剂量的生理盐水。采用免疫组化法(ELISA)检测PI3K、AKT、SDF-1α、CXCR4蛋白,TUNEL法检测细胞凋亡。结果与模型组比较,补阳还五汤组和银杏叶片组PI3K、AKT蛋白表达及SDF-1α、CXCR4阳性细胞数显著增高(P<0.05);模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组大鼠TUNE阳性细胞较假手术组显著增加(P<0.05);补阳还五汤组和银杏叶片组TUNE阳性细胞较模型组显著减少(P<0.05)。结论补阳还五汤能够激活CXCR4-PI3K自噬轴,既能够激发细胞自噬,又能够调控细胞自噬状态,实现抑制细胞凋亡的脑保护作用。

4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

目的研究4-苯基咪唑(4-PI)+氢氧化铝[Al(OH)_3]复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法实验设置7个分组,分别是:阴性对照组(1×PBS),铝佐剂组[HepA-1+Al(OH)_3],疫苗组(HepA-1),M1[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI500μg]组,M2[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1 mg]组,M3[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1.5 mg]组和M4(HepA-1+4-PI 1mg)组,200μL HepA-1,24μL Al(OH)_3,随机分配小鼠,7只/组,分别皮下注射300μL,接种一次。用间接酶联免疫吸附法测试抗-甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体滴度,检测时间为免疫后4周、8周、12周、16周。实验过程中,观察和记录小鼠的健康情况。结果除阴性对照组,其余各组4个时间点均检测到抗-HAV IgG抗体,12周达到峰值。M2组在整个检测阶段抗体水平最高,显著高于疫苗组(t=4.449、3.633、2.565、6.809,P<0.05)和M4组(t=6.256、4.796、4.153、4.113,P<0.05),且第4周高于铝佐组(t=-2.877,P<0.05);M4组在4个时间点检测到的抗体水平与疫苗组相当。4-PI最佳剂量组是1 mg/只。实验全程观察到小鼠每项生理指标均正常。结论 4-PI+氢氧化铝复合佐剂能增强HepA-1诱导的小鼠体液免疫应答,有望开发成HepA-1新型复合佐剂。

CXCR4-PI3KⅢ-自噬轴与结肠癌LoVo细胞转移潜能相关性研究

目的:探讨调控CXCR4-PI3KⅢ-自噬轴对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:实验分为正常LoVo细胞组、介导CXCR4-RNAi慢病毒转染LoVo细胞组(CXCR4-RNAi组)和无意义慢病毒转染LoVo细胞组(NC组)。采用Q-PCR检测PI3KⅢmRNA表达,蛋白质印迹法检测PI3KⅢ、LC3-Ⅱ及Beclin 1的表达,激光共聚焦显微镜观察绿色荧光颗粒,透射电镜观察自噬溶酶体,Transwell小室评价LoVo细胞迁移与侵袭能力。结果:PI3KⅢmRNA表达量正常LoVo细胞组为1.09±0.11,NC组为1.07±0.25,CXCR4-RNAi组为0.86±0.06。PI3KⅢ相对表达量CXCR4-RNAi组为0.227±0.023,低于正常LoVo细胞组的0.607±0.012(P<0.001)和NC组的0.667±0.040(P<0.001),正常LoVo细胞组和NC组差异无统计学意义,P=0.310。LC3-Ⅱ相对表达量CXCR4-RNAi组为0.083±0.012,低于正常LoVo细胞组的0.233±0.015(P<0.001)和NC组的0.253±0.020(P<0.001),正常LoVo细胞组和NC组差异无统计学意义,P=0.184。Beclin 1相对表达量CXCR4-RNAi组为0.207±0.012,低于正常LoVo细胞组的0.440±0.053(P=0.134)和NC组的0.650±0.252,P=0.011。绿色荧光颗粒和自噬溶酶体数量正常LoVo细胞组和NC组明显多于CXCR4-RNAi组。CXCR4-RNAi组迁移实验细胞计数(87.7±9.1)低于正常LoVo细胞组的126.3±4.9(P=0.009)和NC组的115.0±18.7(P=0.035)。CXCR4-RNAi组侵袭实验细胞计数(88.7±10.5)低于正常LoVo细胞组的109.7±4.7(P=0.019)和NC组的107.7±8.1,P=0.029。结论:CXCR4-PI3KⅢ-自噬轴可调控结肠癌LoVo细胞自噬状态,影响肿瘤细胞迁移和浸润,可能是恶性肿瘤浸润转移的机制之一。

石菖蒲通过CXCR4-PI3K信号通路对脑出血大鼠小胶质细胞自噬的影响

目的:研究石菖蒲通过趋化因子受体4(chemokin receptor 4,CXCR4)-磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)信号通路对脑出血大鼠小胶质细胞自噬的影响及神经保护作用。方法:40只健康SD雄性大鼠采用Rosenberg法建立脑出血大鼠模型,另选10只为假手术组。建模成功的36只大鼠随机分为模型组及石菖蒲低(0.5 g·kg^(-1))、中(1 g·kg^(-1))、高(2 g·kg^(-1))剂量组,每组9只。石菖蒲低、中、高剂量组腹腔注射不同剂量的石菖蒲溶液,假手术组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水,每天1次,连续给药7 d。Garcia法对大鼠进行神经功能缺损评分;HE染色观察大脑皮质变化;电子显微镜下观察大脑皮质小胶质细胞自噬的超微结构;RT-qPCR检测CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1的mRNA相对表达量;Western blot检测CXCR4、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、Beclin-1蛋白相对表达量。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分显著降低,CXCR4、Beclin-1的mRNA水平及CXCR4、Beclin-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,石菖蒲给药组神经功能缺损评分显著升高,CXCR4、Beclin-1的mRNA水平及CXCR4、Beclin-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。HE染色显示,假手术组脑组织细胞正常,模型组脑组织病理损伤严重,细胞排列散乱,胞核固缩,细胞间隙增大;石菖蒲给药组脑组织病理损伤、细胞排列散乱程度均减轻,其中石菖蒲高剂量组效果最明显。结论:石菖蒲可抑制脑出血大鼠小胶质细胞自噬且具有神经保护作用,其机制可能与抑制CXCR4-PI3K信号通路激活有关。