A25Δ43K OMP基因缺失株和亲本株对坏死杆菌生物被膜和耐药性影响的比较与分析

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum,F.necrophorum)是一种严格厌氧的革兰阴性菌,感染动物可引起反刍动物腐蹄病、肝脓肿、犊牛白喉、乳房炎和子宫内膜炎等疾病。生物被膜的存在是造成细菌持续感染的重要原因之一。细菌黏附素在生物被膜形成初期的不可逆附着阶段起重要作用。43K OMP是坏死杆菌重要的外膜蛋白之一,具有介导坏死杆菌黏附的功能,43K OMP对生物被膜形成是否产生影响尚未有人报道。通过对坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43K OMP的生物被膜初期不可逆附着阶段细菌数、生物被膜成熟时间、生物被膜形态和耐药性进行检测。结果显示,坏死杆菌缺失43K OMP基因对生物被膜成熟时间无显著影响,会导致成熟生物被膜含量显著增多,接种24 h不可逆附着阶段细菌含量显著减少,生物被膜形态更早出现聚集性菌落和沟壑状结构,对卡那霉素、庆大霉素、安普霉素和磺胺嘧啶的耐药性减弱。43K OMP基因缺失促进坏死杆菌形成生物被膜,抑制坏死杆菌对氨基糖苷类药物的耐药。为坏死杆菌43K OMP基因的功能研究和坏死杆菌病的治疗提供新的研究思路。

A25Δ43K OMP基因缺失株和亲本株对坏死杆菌生物被膜和耐药性影响的比较与分析

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum,F.necrophorum)是一种严格厌氧的革兰阴性菌,感染动物可引起反刍动物腐蹄病、肝脓肿、犊牛白喉、乳房炎和子宫内膜炎等疾病。生物被膜的存在是造成细菌持续感染的重要原因之一。细菌黏附素在生物被膜形成初期的不可逆附着阶段起重要作用。43K OMP是坏死杆菌重要的外膜蛋白之一,具有介导坏死杆菌黏附的功能,43K OMP对生物被膜形成是否产生影响尚未有人报道。通过对坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43K OMP的生物被膜初期不可逆附着阶段细菌数、生物被膜成熟时间、生物被膜形态和耐药性进行检测。结果显示,坏死杆菌缺失43K OMP基因对生物被膜成熟时间无显著影响,会导致成熟生物被膜含量显著增多,接种24 h不可逆附着阶段细菌含量显著减少,生物被膜形态更早出现聚集性菌落和沟壑状结构,对卡那霉素、庆大霉素、安普霉素和磺胺嘧啶的耐药性减弱。43K OMP基因缺失促进坏死杆菌形成生物被膜,抑制坏死杆菌对氨基糖苷类药物的耐药。为坏死杆菌43K OMP基因的功能研究和坏死杆菌病的治疗提供新的研究思路。

牛坏死杆菌43K OMP的生物信息学分析及B细胞表位预测

为了对牛坏死杆菌43K OMP进行生物信息学分析,并预测其B细胞表位,研究利用Prot Param在线软件、TMHMM在线软件、Net Phos软件、DNA star软件和I-TASSER在线软件,分别对43K OMP的理化性质、跨膜区、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行分析,用Bepipred在线软件和Ellipro在线软件对其B细胞表位进行预测,并对预测的表位肽进行验证。结果表明43K OMP共编码377个氨基酸,相对分子质量为42.927×10^(3),理论等电点为8.74,该蛋白在1-20aa处存在信号肽区域,无跨膜区,包括34个磷酸化位点,具有10个构象B细胞表位,多个线性B细胞表位,合成的4表位肽经ELISA验证显示反应性良好。通过生物信息学技术分析出43K OMP的性质及结构,预测出其具有多个B细胞表位,为该蛋白的功能研究及基因工程疫苗的研制提供依据。

牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体的制备

为了评价牛坏死杆菌外膜蛋白43K OMP 的免疫原性,试验利用大肠杆菌原核表达系统对牛坏死杆菌43K OMP基因进行表达,纯化目的蛋白免疫兔,制备牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,并对其进行鉴定。对基因序列进行预测分析后,针对大肠杆菌稀有密码子优化合成该基因序列,克隆至pET-32a 原核表达载体上,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱进行纯化,获得重组蛋白大小约为59 ku。重组蛋白经Western blotting 鉴定后免疫兔,制备多克隆抗体。Western blot 检测牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体与43K OMP重组蛋白具有很好的免疫原性。研究成功制备了牛坏死杆菌43K OMP 多克隆抗体,为以43K OMP蛋白为基础的疫苗研究奠定基础。

牛坏死杆菌43K OMP基因缺失株生物学特性分析

旨在研究牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)43K OMP基因的生物学功能。通过对比亲本株(A25株)和43K OMP基因缺失株(A25Δ43K OMP株)的体外生长速率、药物敏感性、生物被膜形成能力、对细胞的黏附能力、毒性以及对Balb/c雌性小鼠致病力,初步研究43K OMP基因在坏死杆菌致病中潜在的生物功能。结果显示,当43K OMP基因被缺陷后,牛坏死杆菌的体外生长速率和对细胞的毒性无显著差异(P>0.05);对克拉霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、奈替米星、呋喃妥因、多黏菌素B、利福平和环丙沙星耐药性减弱;培养72和96 h后,生物被膜形成能力显著增强(P<0.05);与BEND细胞共孵育1 h后,细菌黏附能力显著降低(P<0.05);对Balb/c雌性小鼠致病力明显减弱(P<0.05)。因此,43K OMP基因主要与坏死杆菌的黏附能力、生物被膜形成能力和耐药性有关。

牛坏死杆菌43K OMP的截短表达及多克隆抗体的制备

为制备牛坏死杆菌截短43K OMP多克隆抗体,以A25菌株基因组DNA为模板,特异性扩增43K OMP基因的4个相互重叠的截短片段,构建原核表达载体,利用大肠杆菌原核表达系统对截短基因进行表达并纯化蛋白,同时免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明:43K OMP基因截短片段经IPTG诱导成功表达,蛋白大小分别为32 kDa、30 kDa、28 kDa和30 kDa,运用蛋白制备的多克隆抗体43K OMP-1、43K OMP-2、43K OMP-3和43K OMP-4的效价分别为1∶25600、1∶51200、1∶25600和1∶51200,且制备的抗体能识别天然43K OMP。

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法经IPTG诱导表达重组43K OMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定。结果获得3株稳定表达抗43K OMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,取其中效价最高的1株命名为O43,其重链为IgG1,轻链为κ链,上清和腹水效价分别为1∶25 600和1∶105;该单克隆抗体可与重组43K OMP发生特异性反应,且与转染后瞬时表达43K OMP的BHK-21细胞特异性结合,发生荧光反应。结论成功表达并纯化了43K OMP,制备了牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体,为研究坏死杆菌的感染机制及发病机理奠定了基础。

牛源坏死梭杆菌43K外膜蛋白的黏附特性研究

旨在明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附特性。将43K OMP基因克隆连接至pET-32a载体,转化入大肠杆菌BL21 DE3中,通过IPTG诱导进行原核表达,应用黏附试验、天然蛋白竞争试验、抗体抑制试验和蛋白酶水解试验,明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附性,同时将纯化的重组蛋白和提取的天然43K OMP与牛子宫内膜细胞和牛乳腺上皮细胞共孵育,观察43K OMP对细胞的黏附作用。结果显示:43K OMP基因克隆到pET-32a载体中,随后在大肠杆菌BL21 DE3以包涵体形式成功表达;携带重组质粒(H2019)的大肠杆菌经IPTG诱导后,与空载体对照相比,与宿主细胞的结合显著增强(P<0.05);天然43K OMP与细胞共孵育后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05);H2019与43K OMP多抗或单抗预孵育后,显著降低黏附宿主细胞的细菌数量(P<0.05);经不同浓度蛋白酶K处理H2019后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05),且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。同时,43K OMP天然蛋白和重组蛋白能黏附于牛子宫内膜细胞和乳腺上皮细胞表面。牛源坏死梭杆菌43K OMP能黏附宿主细胞,43K OMP作为一种黏附蛋白有助于牛源坏死梭杆菌对宿主细胞的黏附作用。

牛坏死杆菌的43 ku外膜蛋白在其黏附细胞中的作用初步分析

旨在明确牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)的43 ku外膜蛋白(43K OMP)在其黏附细胞中的作用,本研究将重组43K OMP蛋白和天然43K OMP蛋白与鼠乳腺上皮细胞共孵育,通过免疫荧光方法观察牛坏死杆菌43K OMP对鼠乳腺上皮细胞的黏附作用;同时利用天然蛋白竞争试验和抗体抑制试验明确43K OMP是否介导牛坏死杆菌与细胞的黏附,进一步利用牛坏死杆菌43K OMP基因缺失菌,评价43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附力的影响,阐明43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中的作用。免疫荧光试验结果显示:天然43K OMP和重组43K OMP均能黏附于鼠乳腺上皮细胞表面,天然43K OMP与鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞预孵育后,牛坏死杆菌黏附数量明显下降(P<0.05);牛坏死杆菌与43K OMP多抗或单抗预孵育后,黏附于鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞的牛坏死杆菌数量显著降低(P<0.05);与牛坏死杆菌A25菌株相比,基因缺失菌A25Δ43K OMP黏附宿主细胞能力极显著下降(P<0.01),黏附率分别降低了94.4%和90.4%。因此,43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中发挥关键性作用,深入研究其黏附机理将为揭示牛坏死杆菌致病机制提供理论基础。