运用454焦磷酸测序技术对病原菌16S-rDNA的分析

目的探讨运用测序技术鉴定临床感染标本中病原菌的应用价值。方法运用聚合酶链反应(PCR)扩增及454焦磷酸测序技术,对标本中病原菌16S-rDNA V3区进行多样性分析;并与细菌培养结果相比较。结果测序能检测出临床不宜培养的菌属,如支原体属、嗜血杆菌属、莫拉菌属等;9种菌属为2种方法共同检测所得,7种菌属的P值均<0.05。结论 2种方法的检测敏感性差异有统计学意义;与细菌培养相结合是临床实践中的一种新的偿试。

运用454焦磷酸测序技术对断奶前后仔猪肠道菌群的分析

本研究旨在运用454焦磷酸测序技术分析断奶前后仔猪肠道菌群的变化。随机选取胎次和出生时间相近的、体重差异不显著的健康"杜×长×大"外三元新生仔猪12头用于试验。整个试验期间由母猪按常规哺乳直到断奶(25日龄),母猪饲粮不含有抗生素,仔猪于12日龄开始饲喂教槽料。于25日龄(断奶前)和32日龄(断奶后)分别随机挑选3头仔猪进行心脏放血屠宰,无菌采集盲肠内容物,运用454焦磷酸测序技术分析断奶前后仔猪盲肠内容物中菌群结构的变化。结果表明:与断奶前仔猪相比,断奶后仔猪腹泻率显著增加(P<0.05);肠道中菌群多样性增加;肠道中拟杆菌门(Bacteroidetes)含量变化不显著(P>0.05),厚壁菌门(Firmicutes)含量显著增加了63.95%(P<0.05),梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)含量分别显著减少了100.00%和70.54%(P<0.05)。对厚壁菌门含量进行深入分析发现,在纲的水平,与断奶前仔猪相比,断奶后仔猪肠道中梭菌纲(Clostridia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)含量有减少的趋势(P>0.05),而Negativicutes纲、Erysipelotrichia纲和未知厚壁菌纲含量有增加的趋势(P>0.05)。从门到属的水平,断奶前后仔猪肠道菌群相对丰度不同,有些菌是断奶前仔猪肠道特有的,如嗜胆菌属(Bilophila)、具核梭杆菌属(Fusobacterium nucleatum)、黄杆菌属(Flavobacteriaceae)等,有些菌是断奶后仔猪肠道特有的,如费克蓝姆菌属(Facklamia)、八叠球菌属(Sarcina)等。由此可见,断奶后仔猪肠道菌群多样性和菌群结构发生了改变。

454焦磷酸测序技术分析A+OSA污泥减量工艺真核生物特征

以缺氧-好氧(AO)工艺为参照,利用454焦磷酸测序技术研究了缺氧-好氧-沉淀-厌氧(A+OSA)污泥减量工艺真核生物分布特征。实验结果表明,A+OSA污泥减量工艺真核生物丰富度与多样性均低于AO参照工艺,两工艺主要真核生物门为环节动物门Annelida,纤毛虫门Intramacronucleata和SAR超类群(不等鞭毛生物Stramenopiles,囊泡虫Alveolates,有孔虫Rhizaria),Annelida及SAR相对含量在减量工艺中明显减低。纲水平分类结果表明,前口纲Prostomatea在减量工艺中消失,寡膜纲Oligohymenophorea在减量工艺贮泥池中成为优势真核生物。A+OSA污泥减量工艺贮泥池中选择性富集真核生物Oligohymenophorea表明微型生物捕食作用存在该工艺中,对减量工艺的污泥减量具有贡献。

454焦磷酸测序技术对不同猪种肠道菌群差异的分析（英文）

454焦磷酸测序用于分析比较巴马香猪(BAMA)、黑香猪(BLACK)与外三元猪(CROSS)的肠道菌群差异。结果表明:三个猪种的肠道细菌多样性与丰度各有不同,差异较大。威克氏菌属、丛毛单胞菌属与光岗菌属等病原菌在BAMA肠道内检测到,而在BLACK与CROSS肠道内未检测到。BAMA肠道中丝状杆菌属与瘤胃球菌属等纤维素分解菌的多样性与丰度远大于在BLACK与CROSS肠道中的分布量。BAMA肠道内高含量的潜在病原菌与纤维分解菌表明BAMA对恶劣环境的适应性与抗病力较强,以及耐粗饲性强,容易饲养管理。

基于454焦磷酸测序法的典型草原土壤真核生物多样性

利用454焦磷酸测序法对黄土区不同封育时期典型草地土壤真核生物多样性进行了研究。结果表明,选择的V4区引物可以扩增出土壤真核生物中的微生物、动物和植物,其中真菌群落主要由子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、绿藻门(Chlorophyta)、球囊菌门(Glomeromycota)和变形菌门(Proteobacteria)组成;动物群落区系主要包括脊椎动物门(Craniata)、节足动物门(Arthropoda)、线虫门(Nematoda)和环节动物门(Annelida);植物群落包括陆生植物(Embryophyta)和单子叶植物纲(百合纲)(Liliopsida)。在不同分类学水平,不同封育时期草地真菌群落组成具有各自的优势菌群;动物群落组成仅在种水平存在差异。草地管理实践中可以结合土壤微生物和土壤养分恢复时间的阈值对封育草地进行合理利用。454焦磷酸测序法可以用于土壤中未知动物、植物和微生物区系的研究。

焦磷酸测序技术在4种食源性致病菌快速检测中的应用

为建立一种利用焦磷酸测序技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella)的方法,通过对4种菌毒力靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,摸索出最佳的焦磷酸测序反应体系和反应程序,并建立了4种食源性致病菌焦磷酸测序快速检测方法。此方法以传统国标法的前增菌为前提,而省去了后期生化验证的繁琐过程,大大缩短了检测时间,并且其准确性与传统生化验证完全一致,灵敏度可达10 CFU/mL。结果表明,作者建立的焦磷酸测序检测方法具有高效、快速、精准及操作简便等特点,为食源性致病菌的快速鉴定开辟了广阔的前景。

焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用

结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PyrosequencingTechnology,PSQ)进行第2601、79199、4791、9838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A/G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。

焦磷酸测序技术检测UGT1A3和UGT2B7在中国汉族人群中的基因多态性

目的建立焦磷酸测序技术(pyrosequencing)研究二相代谢酶UGT1A3和UGT2B7基因多态性在中国汉族人群中的分布。方法应用带生物素标记扩增引物并经PCR扩增和Beads分离,制备UGT1A3和UGT2B7焦磷酸测序单倍摸板。在PYroMarkID焦磷酸测序上进行焦磷酸测序,检测233血样的DNA标本的17个SNP位点,以确定血样DNA标本的的基因型。结果 233例血样的DNA标本中,UGT1A3等位基因有9种表型,分别为UGT1A3*1*1、UGT1A3*1*2、UGT1A3*1*3、UGT1A3*1*4、UGT1A3*1*5、UGT1A3*2*3、UGT1A3*2*4、UGT1A3*3*3和UGT1A3*3*5。UGT2B7-1和UGT2B7-2各有3种基因型,分别为G/G型、G/T型、T/T和C/C型、C/T型、T/T型。结论我国汉族人群中UGT1A3和UGT2B7基因突变较高。

用VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低的临床少见病原菌评价焦磷酸测序技术鉴定能力

目的用焦磷酸测序技术鉴定经VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低或无法鉴定的46株细菌,对两种方法在少见菌的鉴定能力进行评价。方法选择经VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低或无法鉴定的46株细菌(包含革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、革兰阴性球菌及革兰阴性杆菌),提取DNA模板,做焦磷酸测序技术分析;同步进行Sanger法测序并以其结果作为准确鉴定的"金标准"。结果焦磷酸测序技术在4 h内完成46株细菌的鉴定。焦磷酸测序技术鉴定正确率为71.74%(33/46),VITEK 2 Compact系统鉴定正确率为43.48%(20/46)。46株菌中,两种方法鉴定均鉴定正确的菌株19株;焦磷酸测序技术鉴定正确、VITEK 2 Compact系统鉴定准确率低、未鉴定或鉴定错误的菌株14株;VITEK2 Compact系统鉴定正确、焦磷酸测序技术鉴定错误的菌株1株;两种方法均鉴定错误的菌株12株。结论对于微生物实验室利用传统方法无法准确鉴定的细菌,利用焦磷酸测序技术鉴定具有准确、快速及简便的特点,可适用于临床少见病原菌的鉴定。

基于焦磷酸测序分析技术的金银花掺伪鉴别方法研究

金银花是大宗药材,市场掺伪时有发生,但目前的检测方法不能满足快速准确的检测需求,因此亟需建立快精准的检测方法。为了确立高精准度和大通量的金银花掺伪鉴别检测方法,结合SNP标记及焦磷酸测序分型分析技术,对金银花及其常见伪品差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析。结果发现,运用焦磷酸测序技术对金银花和山银花的差异性SNP位点进行定量分析,能够对金银花真伪及掺伪量进行鉴定。该方法兼有PCR技术的灵敏性和焦磷酸测序技术的准确性,具有重复性好、自动化程度较高、易操作的特点,能在3小时之内完成金银花成分掺伪量的检测工作,并得出量化结果。

PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用

宫颈癌是严重危胁妇女生命健康的最常见恶性肿瘤之一,全球每年新发病例约52.98万,死亡病例25.51万,80%发生在发展中国家[1]。早期宫颈癌如能及时发现并治疗,治愈率可达90%以上。高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素,不同HPV亚型引起宫颈癌的危险性不同,其中HPV16和HPV18是致癌能力最强的基因型,70%的浸润性宫颈癌与其相关[2]。因此,HPV感染筛查及型别检测是预防和控制子宫颈癌的重要手段。对30~65岁已婚妇女而言。

焦磷酸测序技术及其应用进展

焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。

焦磷酸测序技术的原理及应用

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应,适于对已知的短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美,而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳,也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色,具备同时对大量样品进行测序分析的能力。在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医鉴定研究等方面有着越来越广泛的应用。

杜鹃花菌根真菌454焦磷酸测序的样品制备

454焦磷酸测序已成为真菌群落结构研究的常用手段,文中对454焦磷酸测序的Barcoded PCR扩增中的模板质量浓度、Mg2+和引物浓度等反应条件进行了优化,并对扩增所得产物的特异性进行了鉴定;同时就不同Taq酶对测序结果的影响进行了讨论。结果表明:DNA模板经适度稀释能显著提高反应效率;Mg2+及引物浓度对扩增反应效率有影响,建议上下游引物浓度均为0.1μmol·L-1,Mg2+浓度可不做调整;使用特异性好、活性较强的Taq酶对保证扩增产物的真菌特异性至关重要,建议选用热启动Taq酶。

焦磷酸测序技术对阿司匹林个体化用药相关SNP位点分型

阿司匹林的抗血小板作用在临床存在显著的个体差异,而rs5918、rs12041331和rs730012 3个单核苷酸多态性位点与阿司匹林的药效和不良反应有着密切的联系。本文基于PCR结合焦磷酸测序技术,建立了阿司匹林相关SNP位点的基因分型方法。自主设计扩增引物和测序引物;优化PCR扩增条件,使3个位点能够在相同的条件下扩增并通过梯度稀释基因组DNA检测方法的灵敏度;最后,分别基于本文建立的新方法和Sanger测序技术对20例临床样本进行3个位点的基因分型,验证该方法的准确性。结果显示,本文成功建立了阿司匹林个体化用药相关SNP位点的基因分型方法,检测下限低至0.4 ng基因组DNA,用两种方法对20例临床样本进行3个位点的基因分型,结果完全一致,说明该方法有较高的准确性。

应用焦磷酸测序技术快速检测食品中沙门氏菌

设计出适合特异性扩增引物和测序引物,采取焦磷酸测序技术对沙门氏菌invA毒力靶基因特异性序列分析,同时对焦磷酸测序反应条件进行优化,建立1种利用焦磷酸测序技术检测和鉴定沙门氏菌的方法。结果显示,此方法以传统国标法的前增菌为前提,可省去后期生化验证的繁琐过程,将检测时间由常规检测的4～7d缩短至20h,并且其准确性与传统生化验证完全一致。所建立的针对沙门氏菌的焦磷酸测序检测方法具有高效性、精准及操作简便等特点,适用于食品中沙门氏菌的快速检测。

应用454测序技术评价非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群结构差异

目的阐明非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者肠道菌群结构特征。方法采用454焦磷酸测序技术,对47例经＂肝活检＂确诊的NAFLD患者和34例健康人新鲜粪便样品16S DNA V3-V5可变区进行测序,通过序列比较及操作分类单元（OTU）划分评价肠道菌群结构差异。结果 NAFLD患者OTUs为（88.32±28.27）,显著低于健康人[（109.65±30.65）,P〈0.01];在＂门＂水平,NAFLD患者厚壁菌门所占比例为（51.2±17.8）%,显著高于健康人的[（46.4±12.8）%,P=0.048],而拟杆菌门为（31.6±18.9）%,显著低于健康人的[（43.3±14.4）%,P〈0.001];在＂纲＂水平上,NAFLD组Erysipelotrichi纲占（3.2±5.1）%,显著高于健康人的[（1.0±1.2）%,P=0.009],而Bacteroidia纲占（31.0±18.8）%,显著低于对照组的[（42.3±14.0）%,P=0.004];在＂属＂水平上,NAFLD组乳球菌占（0.0038±0.0001）%,低于健康组的[（0.0145±0.001）%,P=0.003],普氏菌属也同样显著减少（P=0.022）,而链球菌（Streptococcus）在NAFLD占（1.50±0.03）%,显著高于对照组的[（0.21±0.24）%,P=0.004]。结论 NAFLD患者肠道菌群多样性减少,存在构成显著异常,是致病因素抑或其后果仍有待于进一步研究。

焦磷酸测序技术可检测和鉴定H7N9亚型禽流感病毒

中国动物卫生与流行病学中心的研究人员通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对，发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物，建立了H7N9亚型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。

454测序技术在医学昆虫研究中的应用

医学昆虫是具有医学和经济双重意义的重要媒介生物，严重影响人们生活质量与身体健康。防制技术的进步是基于对其生物学认识（如生态习性、生理特点）的深入，但目前从基因组角度的了解却知之甚少。为此，研究人员采用下一代高通量测序技术从组学角度进行研究，其中454焦磷酸测序技术兼具经济性与读长最长的特点，尤其适合于无参考基因组的非模式医学昆虫应用。本文简介了454测序原理，主要从技术特点、应用范围等角度将其与Solexa测序、基因芯片技术进行比较；综述了近期在医学昆虫领域取得的研究结果，包括抗药性分子机制、虫媒病原体检测、系统发育及分类鉴定、重要生理功能相关转录谱分析等，以期为其在更多媒介生物中的应用提供指导。