AKT反馈激活拮抗4EGI-1对黑素瘤A375细胞的抑制作用

目的:探索4EGI-1对黑素瘤A375细胞中AKT通路的激活作用及后者对4EGI-1抑制A375细胞增殖的影响。方法:用20、40、60μmol/L的4EGI-1处理黑素瘤A375细胞12、24 h,Western boltting检测4EGI-1对A375细胞中AKT磷酸化的影响;A375细胞分别受4EGI-1(40μmol/L)、BEZ235(5μmol/L)、4EGI-1(40μmol/L)+BEZ235(5μmol/L)联合处理,CCK-8实验和流式细胞术分别检测4EGI-1、BEZ235单独或联合处理对A375细胞增殖和细胞周期的影响,Western boltting检测对细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达的影响。结果:4EGI-1促进A375细胞中AKT的磷酸化,且具有剂量依赖性;而BEZ235能够拮抗4EGI-1对AKT的促磷酸化作用。与4EGI-1组和BEZ235组相比,联合组的A375细胞增殖抑制率显著升高[24 h时,4EGI-1组和BEZ235组抑制率分别为(7.6±1.2)%和(2.4±3.1)%,而联合组抑制率为(19.8±4.3)%;P<0.05],S期细胞比例显著降低(4EGI-1组和BEZ235组S期细胞比例分别为25.65%和25.82%,联合处理组细胞S期为13.08%;P<0.05),Cyclin D1表达显著降低(4EGI-1组和BEZ235组Cyclin D1相对表达值为0.81±0.04和0.76±0.04,联合处理组细胞Cyclin D1相对表达值为0.25±0.03;P<0.05)。结论:AKT反馈激活拮抗4EGI-1对黑素瘤A375细胞的抑制作用,联合使用AKT抑制药物能够增强4EGI-1对A375细胞的生长抑制作用。

4EGI-1通过下调Bcl-2诱导K-RAS基因突变型结直肠癌细胞凋亡

目的:研究真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E,eIF4E)/eIF4G相互作用抑制剂4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞HCT116和DLD1增殖和凋亡的影响,及可能的作用机制。方法:采用MTT法和FCM法检测不同浓度的4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型HCT116和DLD1细胞(HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT))增殖及凋亡率的影响;蛋白质印迹法检测4EGI-1对HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白caspase3和cleaved-caspase3及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate-ribosepolymerase,PARP)和cleaved-PARP,以及Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-x L、Mcl-1、Bim、Noxa和Puma表达水平的影响。采用慢病毒感染的方法将特异性针对Bcl-2基因的sh RNA(sh Bcl-2)转入HCT116^(KRASWT)细胞,随后用蛋白质印迹法检测Bcl-2的敲减效率。再用MTT法和FCM法检测4EGI-1对敲减Bcl-2表达后HCT116^(KRASWT)细胞增殖及凋亡的影响,并用蛋白质印迹法检测其对HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白PARP和cleaved-PARP表达水平的影响。结果:4EGI-1能明显抑制HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的增殖并呈一定的剂量相关性(P<0.05),且4EGI-1对K-RAS基因突变细胞增殖的抑制作用大于其对K-RAS基因野生型细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。4EGI-1能明显促进HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的凋亡(P<0.05),且K-RAS基因突变型CRC细胞的凋亡率明显高于K-RAS基因野生型细胞(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,4EGI-1能明显上调HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中cleaved-caspase3和cleavedPARP蛋白的表达水平(P<0.05),且4EGI-1作用后明显地降低了HCT116^(KRASG13D)细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05)。Bcl-2在HCT116^(KRASWT)细胞中的表达水平明显高于其在HCT116^(KRASG13D)细胞中的表达水平(P<0.05),敲减Bcl-2基因表达后,与对照组相比,HCT116^(KRASWT)对4EGI-1抑制增殖和诱导凋亡的敏感度增加(P<0.05)。结论:4EGI-1能通过降低Bcl-2表达抑制K-RAS基因突变型CRC细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究为4EGI-1作为潜在靶向药物在临床上对结直肠癌根据分子分型进行个体化治疗提供了理论基础。方法:采用MTT法和FCM法检测不同浓度的4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型HCT116和DLD1细胞(HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT))增殖及凋亡率的影响;蛋白质印迹法检测4EGI-1对HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白caspase3和cleaved-caspase3及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate-ribose polymerase,PARP)和cleaved-PARP,以及Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bim、Noxa和Puma表达水平的影响。采用慢病毒感染的方法将特异性针对Bcl-2基因的shRNA(shBcl-2)转入HCT116^(KRASWT)细胞,随后用蛋白质印迹法检测Bcl-2的敲减效率。再用MTT法和FCM法检测4EGI-1对敲减Bcl-2表达后HCT116^(KRASWT)细胞增殖及凋亡的影响,并用蛋白质印迹法检测其对HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白PARP和cleaved-PARP表达水平的影响。结果:4EGI-1能明显抑制HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的增殖并呈一定的剂量相关性(P<0.05),且4EGI-1对K-RAS基因突变细胞增殖的抑制作用大于其对K-RAS基因野生型细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。4EGI-1能明显促进HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的凋亡(P<0.05),且K-RAS基因突变型CRC细胞的凋亡率明显高于K-RAS基因野生型细胞(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,4EGI-1能明显上调HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中cleaved-caspase3和cleavedPARP蛋白的表达水平(P<0.05),且4EGI-1作用后明显地降低了HCT116^(KRASG13D)细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05)。Bcl-2在HCT116^(KRASWT)细胞中的表达水平明显高于其在HCT116^(KRASG13D)细胞中的表达水平(P<0.05),敲减Bcl-2基因表达后,与对照组相比,HCT116^(KRASWT)对4EGI-1抑制增殖和诱导凋亡的敏感度增加(P<0.05)。结论:4EGI-1能通过降低Bcl-2表达抑制K-RAS基因突变型CRC细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究为4EGI-1作为潜在靶向药物在临床上对结直肠癌根据分子分型进行个体化治疗提供了理论基础。