泌乳奶牛乳腺中LAT1和4F2hc的表达定位研究

采用荧光定量RT-PCR和间接免疫荧光方法对泌乳期高乳蛋白率、泌乳期低乳蛋白率以及干奶期的荷斯坦奶牛乳腺中LAT1和4F2hc的表达变化与定位变化进行研究,结果表明,泌乳期高乳蛋白率的荷斯坦奶牛乳腺中LAT1特异在乳腺腺泡上皮细胞基底侧表达,4F2hc在乳腺腺泡上皮细胞中表达,LAT1和4F2hc的表达量均显著高于泌乳期低乳蛋白率的荷斯坦奶牛和干奶期的荷斯坦奶牛,预示在奶牛乳腺泌乳过程中,LAT1和4F2hc参与调控乳蛋白的生物合成速率。

奶牛不同发育时期乳腺组织LAT1和4F2hc的表达

为研究氨基酸转运载体LAT1的表达与奶牛乳腺发育的关系,应用免疫荧光技术和免疫印迹方法,检测奶牛乳腺组织中LAT1及其辅助蛋白4F2hc表达的情况。结果表明,LAT1和4F2hc共表达于乳腺导管或腺泡的基底侧和顶膜侧;且泌乳期LAT1蛋白表达显著高于其他发育时期,4F2hc蛋白表达量在围产前期达到峰值,泌乳期4F2hc蛋白的表达量恢复至妊娠中期水平。结论:LAT1及4F2hc均特异性表达于不同发育时期奶牛乳腺组织中,提示LAT1参与了奶牛乳腺的发育和泌乳的调控。

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式,进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程,本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化;在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸,采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响;采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路,使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示,在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期(P<0.05,P<0.01);在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平(P<0.01);亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路(P<0.05),而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达(P<0.05,P<0.01),进而极显著抑制β-Casein的合成(P<0.01)。以上研究结果表明,4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关,亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达,进而影响乳蛋白的合成。

小鼠乳腺发育泌乳过程中L型氨基酸转运载体1的表达研究

为阐明L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)的表达与乳腺发育和泌乳功能之间的关系,采用荧光定量RT-PCR技术和激光共聚焦显微技术对青春期、妊娠期、泌乳期和退化期小鼠乳腺中LAT1及其辅因子4F2抗原重链(4F2hc)表达含量和部位的变化进行研究。结果表明,青春期乳腺导管发育缓慢,LAT1和4F2hc在导管上皮细胞膜、肌上皮细胞膜及乳腺脂肪细胞膜上均低水平表达;妊娠期导管上皮细胞增殖分化加速,LAT1和4F2hc在乳腺小叶导管上皮细胞膜基底侧表达,表达水平上调;泌乳期乳蛋白合成和分泌旺盛,LAT1和4F2hc在腺泡上皮细胞膜的基底侧表达,表达量达到峰值;退化期乳腺组织功能性结构消退,乳腺对氨基酸的需求降低,LAT1和4F2hc的表达下降。提示,LAT1/4F2hc是小鼠乳腺组织中转运氨基酸的载体形式,LAT1和4F2hc的表达变化与乳腺发育、泌乳、退化的生理过程中氨基酸的需要量相关。

L型氨基酸转运载体1及其配体在奶牛乳腺中的协同表达研究

为探讨氨基酸转运与乳腺泌乳功能之间的关系,本研究采用激光扫描共聚焦显微技术对泌乳期和干奶期奶牛乳腺中LAT1和4F2hc的表达含量和表达方式进行研究。结果显示,LAT1和4F2hc的蛋白表达含量在泌乳期高乳蛋白率荷斯坦奶牛中显著高于泌乳期低乳蛋白率的荷斯坦奶牛和干奶期的荷斯坦奶牛。泌乳期LAT1和4F2hc协同表达于腺泡上皮细胞基底侧的细胞膜上和围绕导管的肌上皮细胞;干奶期LAT1和4F2hc协同表达于乳导管上皮细胞质膜。相关性分析显示泌乳期和干奶期LAT1和4F2hc在乳腺中的表达高度正相关,相关系数0.810。结果表明,LAT1是奶牛乳腺中负责转运氨基酸的载体,LAT1/4F2hc协同表达与泌乳期乳蛋白生物合成以及干奶期乳腺组织重建紧密正相关。

必需氨基酸上调乳腺腺泡中L型氨基酸转运载体1的表达

为探讨泌乳乳腺中必需氨基酸与L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1)表达之间的关系,本研究通过体外构建奶牛乳腺泌乳模型,采用免疫印迹方法检测生理浓度的必需氨基酸对乳腺腺泡中LAT1及其辅因子4F2重链(4F2heavy chain,4F2hc)表达变化的影响。结果表明,生理浓度的必需氨基酸显著上调体外培养的奶牛乳腺腺泡中LAT1和4F2hc的表达,提示LAT1是奶牛乳腺上皮细胞内负责转运必需氨基酸的主要转运载体,LAT1和4F2hc的表达受必需氨基酸的诱导。