NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。

NT4-p53(N15)-Ant融合基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建编码融合基因NT4-p53(N15)-Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法:利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)-Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N15)-Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒PJM17共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒Ad.NT4-p53(N15)-Ant,收集病毒上清,大量扩增并测定其滴度,用RT-PCR检测目的基因在293细胞的表达情况。MTT比色法观察重组病毒对HepG2细胞存活率的影响。结果:克隆出p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(1×1011pfu/ml)重组腺病毒表达载体;反转录聚合酶链反应证实感染Ad.NT4-p53(N15)-Ant的293细胞中有目的基因的表达。Ad.NT4-p53(N15)-Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤作用,与Ad.GFP比较,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒处理组HepG2细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-p53(N15)-Ant复制缺陷型重组腺病毒,为下一步的肿瘤基因治疗奠定了基础。

NT4p53(N15)Ant重组腺病毒对肝癌细胞腹腔种植瘤的治疗作用

目的研究NT4p53(N15)Ant融合基因重组腺病毒预先感染ICR小鼠腹腔后,对肝癌细胞株H22腹腔种植瘤的治疗作用。方法将16只ICR小鼠随机平均分成2组,分别于腹腔内预先感染Ad-NT4p53(N15)Ant(治疗组)及等量空病毒(对照组)。将H22细胞悬液接种于小鼠腹腔,建立小鼠腹腔泛发性种植瘤模型。根据小鼠生长情况、生存期以及腹水瘤细胞形态、细胞凋亡率和小鼠腹腔内瘤体重量等结果,评价Ad-NT4p53(N15)Ant对H22细胞种植瘤及癌性腹水的治疗效果。结果成功构建了小鼠腹腔泛发性种植瘤动物模型。与对照组相比,Ad-NT4p53(N15)Ant组小鼠生存期延长、腹水的产生时间延迟,腹水中多核巨细胞减少,细胞凋亡及坏死的比率升高,腹腔内瘤体的质量减少。结论 Ad-NT4p53(15)Ant可有效抑制H22肝癌细胞腹腔移植瘤生长,延迟腹水形成,诱导体内腹水瘤细胞凋亡及坏死,延长小鼠生存期。

NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Ap-optin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。

NT4p53(N15)Ant融合基因重组腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

背景与目的:有研究发现P53氨基端15肽与穿膜肽(antennapedia,Ant)的融合肽能迅速穿透细胞膜,直接、快速引起乳腺癌、胰腺癌细胞坏死而非凋亡,但对正常细胞几乎没有毒性。本研究构建缺陷型腺病毒载体表达NT4p53(N15)Ant融合基因,研究其体外抑瘤作用。方法:应用Ad-EasyTM系统,在大肠杆菌同源重组,构建NT4p53(N15)Ant腺病毒表达载体,在HEK-293细胞内成功包装并鉴定后,感染肝癌细胞株HepG2,用倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验及培养基中的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)测定研究其体外抑瘤作用。结果:Ad-NT4p53(N15)Ant对肝癌细胞株HepG2有明显抑制作用,48、72、96h细胞存活率分别为36.67%、20.47%、17.82%,与空病毒处理组比较差异有统计学意义(P<0.05);电镜观察到感染的HepG2细胞胞膜、核膜破坏,胞浆内出现囊泡状物质,染色质聚集。Ad-NT4p53(N15)Ant处理HepG2细胞24、48、72、96h时培养液中LDH释放分别为94、236、267、313U/L,较空病毒处理组明显增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建的腺病毒载体Ad-NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞后能抑制细胞增殖。

可分泌性GLP-1重组慢病毒的构建

目的:为了探讨使用基因治疗在体内分泌表达胰高血糖素样肽-1(GLP-1)方法治疗糖尿病的可行性,构建可分泌表达GLP-1的重组慢病毒。方法:1.将已构建成功的NT4-GLP-1融合基因插入慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO中,构建pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒。2.用慢病毒包装辅助质粒plp1、plp2、plp/VSVG,及重组慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1,四质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞系,包装慢病毒。3.通过免疫组化法染色确定重组慢病毒效应。结果:重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ联合酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳可见在342bp处有一目的片段。该值与NT4-GLP-1融合基因片段的大小一致,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO内。免疫组化结果显示,实验组细胞内出现大量棕黄色颗粒,阳性细胞达到70%以上,对照组中没有阳性细胞,所以说明NT4-GLP-1重组慢病毒在细胞中可以正确地分泌表达GLP-1。结论:NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒构建正确,病毒包装成功。

重组腺相关病毒-NT4p53(C22)Ant对肝癌荷瘤小鼠的治疗作用

目的研究NT4p53(C22)Ant重组腺相关病毒(rAAV)对肝癌荷瘤小鼠的治疗作用。方法构建NT4p53(C22)Ant,将其亚克隆于重组腺相关病毒载体中,经293细胞包装、扩增构成具有感染性的rAAV-NT4p53(C22)Ant,将小鼠源的H22肿瘤细胞接种于ICR小鼠皮下,成瘤后根据瘤体质量、抑制率、动物生存时间及病理组织学结果,评价rAAV-NT4p53(C22)Ant治疗肝癌细胞(H22)的移植瘤作用。结果一次性肿瘤局部注射NT4p53(C22)Ant重组腺相关病毒100μl/次(2×1011pfu/ml)接种于ICR荷瘤小鼠皮下的H22肝癌细胞,12只小鼠7只瘤块消失,1只死亡,瘤体的质量明显减小,生存时间大于70d;而对照组中,7只小鼠均死亡,死亡率100%,生存时间约为30d,较治疗组明显缩短。治疗组肿瘤抑制率大于90%,较未治疗和注射空病毒对照组有显著性差异,组织学观察rAAV-NT4p53(C22)Ant治疗组较对照组肿瘤细胞明显减少。结论NT4p53(C22)Ant重组腺相关病毒可以有效地杀伤小鼠体内的H22肝癌细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,生存期延长。

rLent/NT4-NAP对老年性痴呆大鼠海马神经元保护作用的研究

目的探讨神经保护肽慢病毒(rLent/NT4-NAP)对老年性痴呆(AD)大鼠海马神经元的保护作用。方法选择无菌级雄性Wister大鼠40只,随机分为对照组,假手术组,AD组,rLent/NT4-NAP组,每组10只。建立β-淀粉样蛋白(Aβ)大鼠海马注射的实验性AD大鼠动物模型[2],利用水迷宫试验检测大鼠记忆能力,组织切片HE染色观察大鼠海马神经元变化,免疫组织化学染色观察caspase-3的表达。结果与AD组相比,rLent/NT4-NAP组水迷宫试验逃避潜伏期明显缩短,错误次数显著降低(P<0.01);HE染色可见rLent/NT4-NAP组大鼠海马损伤神经元数量较AD组少;免疫组化:rLent/NT4-NAP组大鼠海马区caspase-3阳性细胞数较AD组明显减少,但较对照组caspase-3阳性细胞数增加。结论NAP对老年性痴呆大鼠海马神经元具有保护作用。

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的:构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法:使用互补引物/模板法及T载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4-Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果:经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽Exendin-4 cDNA克隆,得到高滴度(2.5×109pfu·L-1)的重组腺相关病毒。结论:通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG/NT4-Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。

表面活性剂对Co3O4改性TiO2纳米管形貌及光催化性能的影响

采用电化学还原-热处理法得到Co3O4/TiO2NTs(二氧化钛纳米管)的p-n异质结构复合催化剂,通过加入表面活性剂聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)获得了高度分散均匀且细小的颗粒。SEM表明通过加入PVP使颗粒大小和空间分布都更加均匀,而混合表面活性剂的协同作用则使负载颗粒尺寸进一步变小。实验结果表明得到的样品与未加表面活性剂的相比,显示出优异的光电流特性和降解亚甲基蓝(MB)染料的性能。

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。

博来霉素致大鼠肺纤维化后神经营养因子4和酷氨酸激酶受体B表达及其意义

目的:探讨博来霉素致大鼠肺纤维化后神经营养因子4(NT4)和酷氨酸激酶受体B(Trk B)的表达及其意义。方法:用36只健康雄性SD大鼠,分为对照组和模型组,每组18只。对照组大鼠为气管内注射生理盐水,模型组大鼠按要求用博来霉素进行气管内灌注。两组大鼠分别于造模后第3、7和14 d各处死6只,取出肺组织,分别用Masson和HE染色检测肺纤维化程度。对照组和模型组大鼠中NT4及Trk B的含量用PCR和免疫组化检测,结果进行统计学分析。结果:与对照组比较,模型组造模后第3、7和14 d NT4和Trk B含量都有不同程度升高,并且随肺纤维化的严重程度而增高(P<0.05),同时NT4和Trk B二者含量的升高呈正相关(r=0.568,P<0.05)。结论:实验大鼠肺纤维化其肺组织中NT4和Trk B表达明显增加,表明NT4和Trk B可能参与肺纤维化的发生发展。这种改变可能与肺上皮细胞增生和Trk B/NT4轴信号传递受影响有关。

NT_4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组载体的构建

目的设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体,为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断,连接于pGEM-T-Easy载体,经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coliDH5α,亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因,经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。

NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca-Ⅱ胰腺癌细胞的杀伤作用

目的:研究NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人M iapaca-Ⅱ胰腺癌细胞杀伤作用.方法:构建NT4p53(C22)Ant,将其亚克隆于腺伴病毒载体中,经293细胞包装、扩增构成具有感染性的重组腺伴病毒AAV-NT4p53(C22)Ant,转染人胰腺癌M iapaca-Ⅱ细胞,经光镜下观察、MTT比色试验、PI染色实验及乳酸脱氢酶释放检测(LDH),观察AAV-NT4p53(C22)Ant对细胞的杀伤作用.结果:光镜下可见随AAV-NT4p53(C22)Ant感染Miapaca-Ⅱ细胞时间延长,肿瘤细胞数目明显减少;MTT实验检测发现细胞存活率明显降低(P<0.05);流式细胞检测凋亡细胞数目较对照组及空病毒组增加(P<0.05);LDH检测培养基中LDH只有轻度增加(P>0.05).结论:重组腺伴病毒NT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞有杀伤作用,并且是通过引起细胞凋亡而实现的.

嵌入式Windows NT 4.0在在线TOC分析仪开发中的应用

PC10 4是测控领域常用的嵌入式硬件平台。在使用其作为在线 TOC分析仪的控制单元时 ,关键问题是选择一个适合的操作系统。根据在线 TOC分析仪的特点 ,操作系统应具备支持 X86系列处理器、支持多任务、支持 TCP/ IP网络协议、实时性要求不高的特点。在PC10 4支持的 Microsoft族的操作系统中 ,嵌入式 Windows NT 4.0和 Windows CE都满足上述条件。 Windows CE是针对手持设备而设计 ,而嵌入式 Windows NT4.0是从 Win-dows NT4.0削减得到的 ,支持完整的 API,更加适合在线 TOC分析仪的设计。目标设计器和组件设计器是嵌入式 Windows NT 4.0的两个生成工具。它们是以模块化的方式削减 Windows NT4.0的内核 ,得到自定义的嵌入式 Windows NT4.0。在嵌入式Windows NT 4.0上进行应用软件开发 ,与通用软件开发的区别不大 ,从而可以加速产品市场化的速度。

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。

神经营养因子4及其受体TrkB在肺纤维化大鼠中的表达

目的:探讨神经营养因子4(NT4)及其受体酷氨酸激酶受体B(TrkB)与大鼠肺纤维化发生发展的关系,为肺纤维化发病机制的研究开辟新的途径。方法:取Wistar健康雄性大鼠30只作为研究对象,分为对照组(气管内注射生理盐水)、模型组(气管内灌注博来霉素)。两组大鼠分别于造模后第7、14、28天各处死5只,取出肺组织,用HE染色及Masson染色来比较造模的程度,用PCR和免疫组化检测模型组及对照组中NT4及TrkB的含量。结果:模型组造模后第7、14、28天NT4及TrkB均有不同程度的增高,且均随肺纤维化程度的增高而增高(P<0.05),二者呈正相关(P<0.001);对照组在对应时间段二者无明显变化(P>0.05)。结论:NT4及其受体TrkB在肺纤维化大鼠中表达增加,可能与肺上皮细胞增生及TrkB/NT4轴的信号传导被扰乱等因素有关,说明NT4及其受体参与肺纤维化的发生发展过程。

用NT4.0构建远程启动Pwin95无盘站技术探讨

详细地探讨了ＮＴ４．０ 远程引导Ｐｗｉｎ９５ 无盘站非标准远程启动网卡配置的关键技术，并给出了组网过程中的一些难点以及安装的具体过程。