5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法在淋巴管研究中的应用

应用5＇-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5＇-Nase-ALPase)双重染色法观察了家兔、豚鼠和Wistar大鼠多个器官的淋巴管和血管.在光镜下见到淋巴管壁呈5＇-Nase阳性反应,显示褐色;而血管壁呈ALPase阳性反应。

改良5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法观察成牙本质细胞层毛细淋巴管

目的:对5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5'-nucleotidase-alkaline phosphatase,5'-Nase-ALPase)双染色法进行改良,并用其染色观察牙髓成牙本质细胞层是否存在毛细淋巴管。方法:选用牙根发育完成的健康恒前磨牙共44个。首先取15个牙,分为3组,分别用单纯冰冻法、先冰冻后固定法、先固定后冰冻法处理牙髓,选取适用于本研究的标本制备方法。然后取8个牙的牙髓切片对5'-Nase-ALPase双染色法从ALPase反应底物量和反应时间上进行改良。最后取21个牙,其中12例牙髓的切片用改良双染色法染色,9例分3组作对照染色,在光镜下观察成牙本质细胞层中的毛细淋巴管。结果:用改良5'-Nase-ALPase双染色法发现在被染为淡蓝色的成牙本质细胞层中有呈褐色或浅黄色的毛细淋巴管。结论:在牙根发育完成的健康恒前磨牙成牙本质细胞层中有毛细淋巴管。

胃癌及胃壁组织内淋巴管分布的研究

本文首次用５′－Ｎａｓｅ－ＡＬＰ双重组织化学方法观察了２０例胃癌组织和癌旁胃壁组织内淋巴管的细微分布。在光镜下毛细淋巴管和淋巴管５′－Ｎａｓｅ染色强阳性，管壁显示明显的棕色或深棕色，而毛细血管和血管的ＡＬＰ反应显示强阳性，管壁呈明显的蓝色。据此可将淋巴管、血管区别开来、本研究发现胃癌组织内有较多的淋巴管、毛细淋巴管以及较多的棕色实性条状组织，这些条状物可能是新生的毛细淋巴管。上述结果为研究癌组织内淋巴管的分布及胃癌淋巴道转移，提供了可靠的实验方法。

膀胱癌及膀胱壁组织内淋巴管分布的研究

该文通过用５’－Ｎａｓｅ－ＡＬＰ双重组织化学方法观察了２０例膀胱癌组织和癌旁膀胱壁组织内淋巴管的细微分布。在光镜下毛细淋巴管５’－Ｎａｓｅ染色强阳性，管壁显示明显的棕色或深棕色，而毛细血管和血管的ＡＬＰ反应显示强阳性，管壁呈明显的蓝色。据此可将淋巴管、血管区别开来。该研究发现膀胱癌组织内有较多的淋巴管、毛细淋巴管以及较多的棕色实性条状组织，该条状物即为新生的毛细淋巴管。这一结果为研究膀胱癌组织内淋巴管的分布及早期淋巴管转移。

淋巴管标记方法及标志物的探讨

目的探讨不同标记方法及标志物在淋巴管检测中的价值,为研究肿瘤淋巴管的生成提供理想实验方法。方法用5′-核苷酸酶(5-′Nase)酶组织化学法对30例正常胃肠新鲜标本(胃及肠组织标本各15例)进行染色观察;用免疫组织化学PV9000法对30例相应胃肠标本石蜡包埋组织行血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)和肾小球足突细胞膜黏蛋白(Podoplanin)染色观察。结果淋巴管密度(LVD):5-′Nase组LVD为6.78±1.16,Po-doplanin组为6.85±0.84,VEGFR-3组为14.33±2.24。VEGFR-3组LVD明显高于5-′Nase组及Podoplanin组,差异均有显著性(t=7.55、7.49,P<0.01),Podoplanin组与5-′Nase组比较差异无显著性(t=0.07,P>0.05)。形态学观察:5-′Nase及Podoplanin标记的阳性淋巴管位于黏膜固有层及黏膜下层,管壁较薄,管腔内无红细胞;VEGFR-3染色阳性的淋巴管较多,位于黏膜固有层及黏膜下层,部分管壁较厚,管腔内见红细胞,且黏膜肌也呈阳性。染色背景:Podoplanin和VEGFR-3免疫组织化学染色背景清晰,能清楚显示阳性淋巴管与周围组织结构的关系;5-′Nase染色背景呈淡黄色,无法观察淋巴管周围的组织结构。结论免疫组织化学技术下Podoplanin染色可以作为标记淋巴管的理想实验方法。Podoplanin是一种比较特异性的淋巴管标志物。

膀胱癌及癌周淋巴管形态学特征与盆腔淋巴结转移

为探讨膀胱癌及癌周淋巴管形态学特征与盆腔淋巴结转移的关系。应用51-Nase-ALP双重染色组织化学方法及透射电镜,观察了24例膀胱癌组织和癌旁膀胱壁组织内淋巴管的细微分布、形态和结构。发现膀胱癌组织内有较多新生的毛细淋巴管;癌周组织中毛细淋巴管的分布明显高于正常组织;随着癌的不断浸润发展,癌周组织毛细淋巴管数量增多、密度增高,形态结构变异,内皮细胞间连接呈开放状态,且可见到癌栓经开放之通道侵入毛细淋巴管内。这一结果说明了膀胱癌及癌周组织淋巴管增生,形态结构变异造成了癌细胞侵入淋巴道转移的可能,也为研究膀胱癌早期淋巴道转移提供了可靠的实验方法。

牙髓淋巴管网的酶组织化学研究

目的 :观察实验动物和人的牙髓淋巴管网的结构与分布特点。方法 :将非脱钙组织和用EDTA溶液脱钙的组织冰冻切片 ,分别应用光镜和电镜HE、5′ Nase单染和 5′ Nase ALPase双重染色作比较观察。结果 :HE染色切片光镜观察仅见管腔样结构 ;5′ Nase单染可见呈深棕色、形状不规则的淋巴管 ;而在同一切片上 5′ Nase ALPase双重染色观察到呈深棕色的淋巴管和呈蓝色的血管。扫描电镜和透射电镜观察牙髓的组织切片 ,见到丰富的呈 5′ Nase染色强阳性的淋巴管 ,5′ Nase反应产物存在于淋巴上皮细胞表面 ,牙髓中央部淋巴管较外围的成牙本质细胞层丰富。结论 :5′ Nase

腹膜毛细淋巴管网的形态结构特征

目的 探讨腹膜淋巴管的形态特征 ,为研究内皮和间皮细胞的物质转运机理提供必要的依据。 方法 用酶组织化学染色法观察了猴腹膜毛细淋巴管网的分布及其内皮细胞的超微结构。 结果 腹膜毛细淋巴管有丰富的网状连接、显著的瓣样结构和大量盲端 ,管径变化较大 (约 40～ 12 0 μm)、管腔极不规则。淋巴管周围结缔组织稀疏 ,并常见到内皮细胞与覆盖其表面的间皮细胞直接相贴。网膜和系膜内可见由大量巨噬细胞及淋巴细胞构成的圆形或椭圆形的乳斑 ,起于乳斑的淋巴管与间皮细胞之间缺乏基底膜。膈腹膜小孔的边缘附着有大量的细纤维成分 ,形成小孔的间皮细胞与其深面的淋巴管窦均有较强的 5’ Nase酶活性。 结论 腹膜毛细淋巴管的形态及结构显示出明显的部位性差异 。

非肥胖型糖尿病小鼠胰腺淋巴管分布及微细结构的酶组织化学研究

应用酶组织化学的方法对非肥胖型糖尿病（ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅｄｉａｂｅｔｉｃ，ＮＯＤ）小鼠胰腺淋巴管的分布及微细结构进行了光镜及电镜观察。５′－核苷酸酶（５′－Ｎａｓｅ）阳性小叶间淋巴管具有明显的神经支配和丰富的瓣膜，分布于整个胰腺。小叶内毛细淋巴管虽有典型的结构特征，如不规则的管腔、极薄的管壁和淋巴管内皮细胞的独特连接方式（端端、重叠与指状突起连接），但数量很少，其分布相对独立于毛细血管（碱性磷酸酶，即ＡＬＰａｓｅ阳性）。胰岛周围淋巴细胞浸润出现在生后４～５周，并开始于近血管或淋巴管一侧。糖尿病发病后，血糖浓度在短期内急剧上升，胰岛由严重的淋巴细胞浸润转化为β细胞脱颗粒及坏死。淋巴管内一般充满大量淋巴细胞。淋巴管内皮细胞内小泡明显增多，并有广泛的细胞质突起。其开放性细胞间连接均匀地附着有５－Ｎａｓｅ反应颗粒，形成了相当大的细胞间通路（５００～１５００ｎｍ），可见细胞或纤维碎片从组织间隙经此进入淋巴管腔。结果提示，糖尿病胰腺的淋巴管对浸润的淋巴细胞、坏死的细胞成分和某些溶质等的转运具有重要的作用。

大鼠牙周组织淋巴管的酶组织化学法研究

目的 :本研究旨在应用酶组织化学双重染色法 ,对大鼠牙周组织中的淋巴管 ,在光镜和电镜下进行观察。方法 :将牙周膜伸展标本固定、超薄切片作电镜观察 ;另将含牙和牙槽骨的标本经EDTA脱矿制作组织冰冻切片 ,进行 5′ Nase染色 ,5′ Nase&ALPase(5′ 核苷酸酶和碱性磷酸酶 )双重染色。结果 :在光镜下观察该染色法的组织切片 ,可证明牙周组织中的淋巴管的存在 ,并将淋巴管与血管相区别 ,即呈现褐色的 5′ Nase阳性的淋巴管 ,呈现兰色的ALPase阳性的血管。用透射电镜可见 5′Nase反应产生的致密颗粒状沉淀物 ,存在于淋巴管内皮细胞的管腔面和基底侧 ,而血管中无此现象。结论 :5′ Nase&ALPase双重染色是研究牙周组织淋巴管的好方法。

热激下小白菜矮杂一号和矮脚黄呼吸作用及游离脯氨酸代谢

以抗热性不同的小白菜品种矮杂一号(抗热性品种)和矮脚黄(对照品种)为材料,测定了其呼吸强度,α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHase)活性、游离脯氨酸(pro)含量和二氢吡啶-5-羧酸还原酶(P_5CR)活性。实验结果表明,当热激温度为40℃和45℃时,矮杂一号呼吸强度持续稳定地上升,而矮脚黄则迅速下降。说明非抗热品种在高温下呼吸代谢不稳定。各个处理温度下,两个品种α-KGDHase活性有相同的变化趋势,矮杂一号稍高于矮脚黄。两个品种从老叶到幼叶的游离pro变化趋势相反。矮脚黄叶片游离pro含量平均值高于矮杂一号。热激时,40℃处理使矮脚黄叶片大量积累游累pro,约为矮杂一号的8倍,游离pro积累与小白菜品种抗热程度成负相关。矮杂一号和矮脚黄的P_5CR活性变化与品种叶片中pro的积累相对应。

Lymphangiogenesis in tumor tissues and 5'-Nase, Flt-4, Flk-1 expressions

To investigate lymphangiogenesis in tumor tissues and 5' Nase, Flt 4, Flk 1 expressions Methods 5' Nase and Aplase expressions and the morphology of lymphatics in gastric carcinoma tissues were observed with enzyme histochemistry Flt 4 and Flk 1 expression in gastric carcinoma and sarcoma tissues was studied by immunohistochemistry CNE 2z cells were implanted into the subdermal layer of nude mice and hyaluronic acid was injected at the same sites After 4 or 5 weeks, nasopharyngeal carcinoma (NPC) xenograft tissues were cut for immunohistochemistry and enzyme histochemistry, and lymphangiogenesis, 5' Nase, Alpase, Flt 4 and Flk 1 expression in NPC tissues was studied Hyaluronic acid contents in sera of the patients with NPC and mice with NPC xenografts were measured by radioimmunoassay Results There were a lot of lymphatics and solid strip like tissues in gastric carcinoma and NPC xenograft treated with hyaluronic acid The total number of lymphatics (26 9±14 2/HP) increased significantly in gastric carcinoma tissues Flt 4 and Flk 1 positive expression was found in gastric carcinoma, sarcoma tissues and NPC xenograft Most of the vessels with positive Flt 4 were lymphatics Flk 1 expression was only found in the walls of blood vessels Hyaluronic acid content (363 52±98 15?ng/ml) in sera of patients with NPC was higher than that of the patients with chronic nasopharyngeal imflammation (306 29±27 15?ng/ml), with a significant difference ( P =0 039) The hyaluronic acid content in sera of nude mice with NPC (2120 59±490 22?ng/ml) was markedly higher than that in normal mice (1588 99±502 12?ng/ml), with a significant difference between them ( P =0 007) Conclusion There are a lot of lymph capillaries with positive 5' Nase in gastric carcinoma and NPC xenograft treated with hyaluronic acid Flt 4 positive expression is shown in gastric carcinoma, sarcoma tissues and NPC xenografts The results suggest there is lymphangiogenesis in these malignant tumor tissues Hyaluronic acid contents in sera of patients with NPC and nude mice with NPC increase, which may promote the formation of lymphatics

电针对骨骼肌钝挫伤模型大鼠细胞周期素依赖性蛋白激酶5表达的影响

目的观察电针对骨骼肌钝挫伤大鼠细胞周期素依赖性蛋白激酶5（CDK5）表达的影响，探讨电针治疗骨骼肌损伤、促进肌肉功能恢复的作用机制。方法将32只sD大鼠按照随机数字表法分为正常组（n=4）、模型组（n=4）、自然恢复组（n=12）、电针组（n=12），正常组不做特殊处理，其余各组使用自制重物打击器建立骨骼肌钝挫伤模型。自然恢复组不做电针干预、自然恢复；电针组于造模48h后开始电针干预，每日1次，每次15rain。模型组于建模24h后处死，目的在于验证造模成功，自然恢复组、电针组分别于造模后第7、14、21天处死取材，使用苏木精．伊红（HE）染色观察组织形态变化，采用免疫印迹和实时定量荧光PCR分别检测CDK5蛋白及其mRNA的表达情况。结果HE染色显示，与正常组比较，各组可见大量肌纤维断裂溶解及炎性细胞浸润。电针组与自然恢复组比较，肌卫星细胞增殖更快，新生肌纤维明显增多，修复更为迅速。自然恢复组、电针组两组CDK5蛋白表达量较正常组均升高（P〈0．05），且电针组明显低于自然恢复组（P〈0．05），PCR检测结果也进一步表明，自然恢复组mRNA表达水平显著高于电针组（P〈0．05），且均高于正常组（P〈0．05）。结论骨骼肌钝挫伤可使大鼠骨骼肌中CDK5蛋白表达升高，电针促进骨骼肌肌肉功能恢复的机制可能与抑制CDK5蛋白及mRNA的表达水平有关。

1,25二羟维生素D_3通过ERK5通路调节破骨细胞分化

[目的]探讨体外1,25二羟维生素D_3(1,25-(OH)_2-VitD_3)通过细胞外信号调节激酶5(extracellularregulated kinase 5,ERK5)信号通路在诱导破骨细胞分化中的作用。[方法]对骨髓来源巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs)进行不同浓度(0,10^(-9),10^(-8),10^(-7)mol/L)1,25-(OH)_2-VitD_3孵育,明确1,25-(OH)_2-VitD_3能否激活ERK5信号通路,并筛选出合适浓度的1,25-(OH)_2-VitD_3激活ERK5。调配不同工作液,分为正常细胞对照组、XMD8-92组、1,25-(OH)_2-VitD_3组及1,25-(OH)_2-VitD_3+XMD8-92组,分别孵育BMMs细胞6 d。采用TRAP染色检测4组破骨细胞的分化水平;Western Blot分别检测p-ERK5、ERK5等蛋白水平变化;RT-PCR检测NFATc1、CAMKⅡmRNA相对表达量。[结果]10^(-8)mol/L的1,25-(OH)_2-VitD_3可显著激活ERK5磷酸化(P<0.05)并通过ERK5通路促进破骨细胞分化(P<0.01),但此效应可被ERK5高选择性抑制剂XMD8-92抑制(P<0.05)。ERK5激活可显著上调破骨细胞CAMKⅡ、NFATc1 mRNA的表达(P<0.01);而XMD8-92可显著抑制CAMKⅡm RNA的表达(P<0.01),但对NFATc1 mRNA无显著影响(P>0.05)。[结论]体外低浓度(10^(-8)mol/L)的1,25-(OH)_2-VitD_3通过激活ERK5信号通路促进破骨细胞分化,CAMKⅡ是破骨细胞中ERK5信号下游通路的重要靶点。