相对荧光定量法检测人体2',5'-寡聚腺苷酸合成酶相对表达水平

目的:建立相对荧光实时定量法(RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)),考察聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液临床Ⅰ期试验中给药后外周全血中2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-OAS)相对药前点的相对表达水平变化。方法:根据Gen Bank中查询的2',5'-OAS的序列构建质粒,并纯化定量作为方法标准品,制作标准曲线及验证样品,考察该方法的准确度及精密度;采用RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)方法,以个体药前样品为对照,GAPDH为内参,比较考察给予聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液(受试品160μg/人)与阳性对照药派罗欣(180μg/人)后外周血中2',5'-OAS mRNA表达变化倍数;同时,基于ELISA方法对2',5'-OAS蛋白浓度表达进行分析。结果:2',5'-OAS标准曲线有相对较好的线性(R2=0.99),cDNA 2',5'-OAS与2',5'-OAS标准品的PCR产物熔解曲线温度一致,说明引物特异性好。2个剂量组中m RNA表达水平均在20 h左右达到峰值,其中160μg剂量组中峰浓度较高。ELISA检测血清中2',5'-OAS浓度无明显变化。结论:与传统蛋白水平检测的ELISA方法相比,RT-QPCR 2_(-ΔΔCt)灵敏度较高,可以作为一种检测外周全血中生物标志物的替代方法,以给予药效学研究的临床支持。

2',5'-寡聚腺苷酸合成酶作为抗病毒药物乐复能的临床药效评价指标的研究

目的：考察抗病毒蛋白I期临床试验受试者的2＇,5＇-寡聚腺苷酸合成酶水平,初步评价抗病毒蛋白乐复能的药效学特性。方法：采用2＇,5＇-寡腺苷酸（2-5A）放免检测试剂盒对I期临床试验血样进行分析,观察2＇,5＇-OAS水平。结果：10μg单次给药后2＇,5＇-OAS活性24-48 h达峰,至给药后120 h,除3#受试者外基本恢复至本底水平。10μg每日连续给药后血清2＇,5＇-OAS活性迅速升高,药后d 5变化趋势接近平台期,至第1次给药后25 d仍能维持在较高水平,至药后39 d,患者血清2＇,5＇-OAS活性值明显降低。10μg隔日连续给药组血清2＇,5＇-OAS活性变化趋势与每日连续给药组近似,但药后39 d尚能维持在较高水平。20μg隔日连续给药组连续7 d给予10μg乐复能后,血清2＇,5＇-OAS活性已升高至平台期,随后的20μg隔日连续给药将血清2＇,5＇-OAS活性值一直维持在较高的水平至连续给药结束。结论：2＇-5＇寡聚腺苷酸合成酶可以作为乐复能的临床疗效评价指标。

2'-5'寡聚腺苷酸合成酶的抗病毒作用及机制研究进展

2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)是干扰素诱导产生的重要抗病毒蛋白,可利用细胞内游离的三磷腺苷合成2',5'-磷酸二酯键连接的寡聚腺苷酸(2-5As),后者活化核糖核酸酶L(RNase L),进而抑制DNA病毒和RNA病毒感染。OAS也是细胞内识别病毒双链核糖核酸(dsRNA)的模式识别受体,能够识别具有一定长度或基序特征的病毒dsRNA分子,避免自身免疫应答产生,维持细胞稳态。本文对活化OAS蛋白的dsRNA特征、活化机制、OAS的抗病毒作用以及病毒逃逸OAS-RNase L通路的作用机制进行总结,以期为后续研究提供参考。

2',5'-寡腺苷酸合成酶基础活性对干扰素α治疗慢性丙型肝炎信号传导的影响机制研究

目的观察慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中2',5'-寡腺苷酸合成酶(2-5AS)基础活性对干扰素(IFN)信号分子改变的影响,探讨IFN-α治疗慢性丙型肝炎的作用机制。方法选择60例慢性丙型肝炎患者,抽取外周血分离出PBMC,每份标本进行2-5AS基础活性测定后分为实验组和对照组,对照组PBMC体外培养时不加IFN-α,实验组PBMC体外培养时加入IFN-α。培养24 h后,测定PBMC中2-5AS活性、IFN-α受体(IFN-αR)、信号传导及转录激活因子(Stat)1、Stat2、两面神激酶1(Jak1)和酪氨酸激酶2(Tyk2)等指标。结果实验组PBMC培养24 h后2-5AS活性、Jak1、Stat1、Stat2和Tyk2等表达明显增高(P<0.05),IFN-αR表达降低(P<0.05)。2-5AS基础活性与IFN-α刺激下PBMC中2-5AS、Tyk2和Stat1的表达呈负相关(P<0.05),而与IFN-αR、Jak1和Stat2的表达无相关性(P>0.05)。结论 2-5AS基础活性可下调PBMC对外源性IFN-α的敏感性,Stat1、Tyk2表达降低可能是下调机制发生的原因。

抗粘病毒1和2′5′-寡腺苷酸合成酶1基因与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞中抗粘病毒1(MX1)基因和2′5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)1基因的实时定量表达水平与SLE临床表现及病情活动度的相关性。方法收集50例SLE患者,20例非SLE其他自身免疫性疾病患者,25例健康对照人群的临床资料,取外周血抽提总RNA并逆转录成cDNA,运用SYBR green dye I实时定量聚合酶链反应(QT-PCR)在ABI PRISM 7000基因测序仪上检测患者和对照组的MX1和OAS1定量表达水平(以ΔCt值表示)的差异,并与各临床指标及病情活动度进行相关性分析。结果①SLE患者总体的MX1 mRNAΔCt值(3.55±1.39)高于非SLE患者组(2.31±0.52,P=0.000)和正常人(2.23±1.05,P=0.000)。②SLE患者组的OAS1 mRNAΔCt值(4.45±1.56)高于非SLE患者组(3.03±0.76,P=0.000)和正常人(2.75±0.64,P=0.000)。③SLE患者组的OAS1 mRNAΔCT值与SLEDAI积分之间有相关性(r=0.338,P=0.019),与血浆IgA水平有相关性(r=0.475,P=0.001)④SLE患者组的MX1 mRNAΔCT值与SLEDAI积分之间无相关性(r=0.064,P=0.661),与甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)2、4 h尿蛋白均有相关性(r=0.428,P=0.003;r=0.383,P=0.009;r=0.394,P=0.007;r=0.316,P=0.025)。⑤在有关节炎的SLE患者中,其MX1和OAS1表达水平升高更明显(3.04±1.42,P=0.004;3.89±1.49,P=0.006)。结论MX1与OAS1在SLE患者中均有表达上调现象,OAS1 mRNA实时表达定量水平对SLE患者的病情活动度判断有意义。二者作为Ⅰ型干扰素诱导表达的基因在SLE发病中均有各自作用。

2',5'-寡腺苷酸合成酶1基因多态性与自发性早产和胎膜早破易感性的病例对照研究

目的探讨2',5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)基因多态性和自发性早产和胎膜早破易感性的关系。方法收集自发性早产儿599例作为病例组,其中包括胎膜早破171例;孕母无自发性早产和胎膜早破病史的673例足月儿作为对照组。采用病例-对照研究,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析检测OAS1内含子区rs10774671位点的单核苷酸多态性。结果病例组和对照组两组间OAS1 rs10774671基因型AA、GA、GG以及等位基因A、G的频率之间的差异均无统计学意义;有无胎膜早破病例组分别和对照组比较,上述频率之间的差异均无统计学意义;不同胎龄的自发性早产亚组分别和对照组比较,上述频率之间的差异均无统计学意义。结论 OAS1基因多态性与自发性早产和胎膜早破易感性之间缺乏关联。

OAS2-751C/A位点基因多态性与儿童EV71感染的关联性研究

目的探讨2’-5’寡聚腺苷酸合成酶2基因5’端调控区751C/A(OAS2-751C/A)位点单核苷酸多态性与肠道病毒71型(EV71)易感性及其病情严重程度的关系。方法选取2014年6月至2015年9月青岛大学附属医院及青岛市妇女儿童医院收治的EV71检测为阳性的患儿215例,参照《手足口病诊疗指南(第2010版)》的标准,根据病情轻重分为轻症组127例,重症组88例。同期收集无感染症状的健康体检儿童174例,提取外周血DNA,利用多重高温连接酶检测反应(i MLDR)技术检测OAS2-751C/A位点基因多态性。利用SPSS16.0对结果进行统计学分析。结果 OAS2-751C/A位点基因型分布及等位基因频率在EV71感染组及对照组之间差异具有显著统计学意义(P<0.05),EV71感染组A等位基因频率明显高于对照组(P<0.05);轻症组与重症组之间基因型分布及等位基因分布频率无明显差异(P>0.05)。结论 OAS2-751C/A位点A等位基因可能与人体对EV71易感性相关,与病情严重程度无关。A等位基因可能是EV71感染的危险因素。

IFN-γ通过激活JAK/STAT信号通路上调手足口病患儿OAS1表达

目的:探讨干扰素γ(IFN-γ)是否可以通过激活Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路上调手足口病(HFMD)患者2',5'-寡聚腺苷酸合成酶1(OAS1)的表达,从而发挥抗病毒感染的作用。方法:收集140例儿童手足口病和60例健康对照儿童外周血标本,RT-qPCR和Western blot检测OAS1 mRNA和蛋白的表达。提取手足口病患儿外周血单个核细胞(PBMCs),常规培养,无血清培养基同步化后分为正常对照组、IFN-γ干预组和AG490+INF-γ联合干预组。在不同时点采用Western blot检测OAS1、JAK和STAT1蛋白表达及磷酸化水平。结果:HFMD患儿外周血OAS1 mRNA和蛋白的表达明显高于正常对照儿童,并且随着HFMD病情加重,OAS1的mRNA和蛋白表达水平进一步显著升高(P<0.01)。IFN-γ能够呈时间依赖性地显著上调HFMD患儿PBMCs中OAS1蛋白的表达。在IFN-γ刺激下,PBMCs中p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白水平及STAT1核蛋白水平较正常培养PBMCs呈时间依赖性升高(P<0.05);而联合加入AG490干预后,PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1和OAS1蛋白水平及STAT1核蛋白水平均较IFN-γ单独刺激组呈时间依赖性显著降低(P<0.05)。结论:IFN-γ能够促进HFMD患儿OAS1的表达,其机制可能与激活JAK/STAT信号通路有关。

OAS基因多态性与肠道病毒71感染易感性关系

目的探讨2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(OAS)1、2、3基因单核苷酸多态性(SNP)与肠道病毒71型(EV71)感染遗传易感性的关系,探讨不同基因型对EV71感染患病风险及病情程度的影响。方法收集2011年11月—2012年12月山东青岛地区的EV71检测为阳性的手足口病病儿163例,提取病儿外周血白细胞基因组DNA,采用序列特异性引物-聚合酶链反应技术检测EV71感染病儿和正常对照儿童OAS1外显子-6区rs1131476(G/A)位点、OAS2内含子-2区rs1293767(G/C)位点及OAS3的5′端rs7132797(C/A)位点SNP。结果组间OAS2内含子-2区rs1293767(G/C)位点基因型CC+GC、GG及等位基因G、C频数分布与OAS3的5′端rs7132797(C/A)位点基因型AA、CA、CC及等位基因A、C频数分布差异无显著性(P>0.05);OAS1外显子-6区rs1131476(G/A)位点基因多态性中基因型AA和等位基因A在重症病儿分布频数较轻症者组明显增高(χ2=6.389、7.002,P<0.05),而EV71感染组与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 OAS1rs1131476(G/A)基因SNP与EV71感染病儿疾病严重程度关系密切;基因型AA和等位基因A携带者在EV71感染中易发展为重症。

不同病毒逃逸OAS/RNase L通路抗病毒作用机制的研究进展

2'-5'寡聚腺苷酸合成酶/RNA酶L(OAS/RNase L)通路是先天性免疫系统的重要组成之一,在抑制病毒增殖和诱导细胞凋亡方面发挥重要作用。OAS/RNase L系统对西尼罗病毒、轮状病毒和骨髓灰质炎病毒等多种病毒具有拮抗作用。但随着研究的不断深入,多种病毒已被发现会通过各自独特的逃逸机制抵抗OAS/RNase L通路的抗病毒作用。作为最早发现的抗病毒通路之一,OAS蛋白家族各成员和RNase L抗病毒作用机制已经有很多综述报道。不同病毒对OAS/RNase L通路抗病毒作用的逃逸机制均不相同,其中甲型流感病毒和牛痘病毒等通过阻遏OAS激活的方式逃逸OAS/RNase L通路的抗病毒作用,轮状病毒和小鼠肝炎病毒等通过降解2',5'寡聚腺苷酸(2-5A)的方式逃逸OAS/RNase L通路的抗病毒作用,丙型肝炎病毒和骨髓灰质炎病毒等则通过抑制RNase L活性的方式逃逸OAS/RNase L通路的抗病毒作用。现对多种病毒同宿主抗病毒通路相互作用机制进行综述,分析OAS/RNase L通路在天然免疫抗病毒作用中的重要性,同时为抗病毒治疗提供新的思路。