丙型肝炎病人系列血清中5'-NCR和C区基因变异研究

目的研究丙型肝炎病人的系列说清中ＨＣＶ ５'－ＮＣＲ及核心区基因变化。方法 ４例因献血感染ＨＣＶ病人的系列血标本，用特异性引物扩增５'－ＮＣＲ和核心区基因并进行测序。结果所有ＨＣＶ分离株基因序列均为１ｂ和２ａ型，５'－ＮＣＲ序列差异只与型别有关，与病人和不同时点采集的标本无关。核心区基因序列差异因病人和基因型别而异，未发现同一病人的同一基因型序列随时间而变化。结论５'－ＮＣＲ序列保守性大于核心区。型别是导致基因变化的主要原因。未发现该２区段基因的核苷酸改变与时间有关。

丙型肝炎病毒NS5b区与5’-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较

为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)NS 5b区与 5’ -非编码区 ( 5’ -NCR)不同基因区RNA检测结果的区别及临床应用价值。利用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)技术检测 148例肝炎患者血清HCVNS 5b基因的cDNA ,并与5’ -NCR基因区cDNA检测技术进行了比较。结果 HCVNS 5b基因区RNA检出率为 2 4.3% ( 34/ 148) ,5’ -NCR基因区RNA检出率为 31.1% ( 47/ 148)。HCV 5’ -NCR基因区扩增效果较好 ,而HCVNS 5bPCR敏感性接近于HCV 5’-NCR检测结果 ,亦可直接应用于临床RNA检测。

丙型肝炎病毒5’端非编码区的5’端序列对其翻译启动活性的影响

目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5’端非编码区(5’NCR)的5’端序列对其翻译启动活性的影响。方法用PCR技术扩增获得全长和5’端17个碱基缺失的HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5’端截短的HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP。用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功。表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P<0.01)。结论HCV5’NCR的5’端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCVIRES的结构提供了实验基础。

丙型肝炎病毒5’非编码区的研究进展

丙型肝炎病毒５’非编码区的研究进展史英辉综述韩世杰审核１９８９年，美国Ｃｈｏｏ等人利用重组ｃＤＮＡ方法发现了非甲非乙型肝炎病毒基因组（图１），后来将该新病毒分类归为黄病毒科的丙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ；ＨＣＶ）。从此，这一重要而又常...

利用脊髓灰质炎病毒5'NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。

中国丙型肝炎病毒基因型的进化树分析

目的了解丙型肝炎病毒的基因型在中国的分布,对各基因型做遗传进化树分析。方法分型方法按5′端非编码区(5′NCR)ABC程序酶切分型技术进行。应用BsrBⅠ、HaeⅡ、HinfⅠ、BstUⅠ、HaeⅢ等5种限制性内切酶,对HCV阳性血清进行分型研究。对1a、3b基因型进行HCVNS5bPCR,测序。对5′NCR和NS5b进行遗传进化树分析。结果测序结果证实中国存在HCV3b和1a型;进化树分析结果表明第86、98、123株样品与3bD49374相关,获美国NCBI的GenBank认证;第61株与HC J1D107491a型相关;5′NCR测序结果证实第16、62株与HC J82b型相关。结果表明中国存在着HCV1a、2b、3b型的感染。结论经过遗传进化树分析证实了ABC程序酶切分型技术可准确地检测1a～6aHCV基因型。

中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列

应用RT PCR和DNA克隆重组技术 ,从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到 3个丙型肝炎病毒 (HCV) 5′端非编码区 (5′NCR)核苷酸序列。这 3个序列分别来自 3个不同的丙型肝炎患者。与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现 ,这 3个HCV 5′NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复。在YS2 2 5 15′NCR序列 - 15 5～ - 174位之间 ,有 18个核苷酸序列缺失 ;在YS2 0 3 4和YS2 42 15′NCR序列 - 5 5～ - 5 6位之间 ,分别有 2 8个 (YS2 0 3 4)和 40个 (YS2 42 1)核苷酸序列插入。这些插入序列 (2 8个核苷酸 )在其相邻部位已有存在 ,即为重复序列。YS2 42 1插入序列中有 11个核苷酸出现两次重复。其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异。结果表明 ,这

甲型肝炎病毒中国流行株5′NCR核苷酸序列异质性研究

目的 了解甲型肝炎病毒中国流行株 5′非编码区 (5′NCR)核苷酸序列的异质性。方法 选择浙江、江苏、安徽、云南等地的甲肝病人粪便或血清标本 ,以逆转录 套式聚合酶链反应 (RT nPCR) ,扩增合成 5′NCR高变区基因片段 ,并进行直接核苷酸序列分析和差异比较。结果 所有甲型肝炎病毒株间 5′NCR高变区核苷酸差异≤ 3nt;与美国株LA差异≥ 4nt;与澳大利亚株HM175差异≥11nt;差异的大小与基因型无关。结论 甲肝病毒基因结构非常稳定 ,变异率极低。

HCV 5'NCR转基因小鼠模型的初步建立

目的 为进行反义核酸抗ＨＣＶ药物的体内活性评价。方法 以含ＣＭＶ启动子的ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ与荧光素酶基因的融合基因为转基因片段，经显微注射导入ＩＣＲ小鼠受精卵原核，由移植鼠获６８只仔鼠，取鼠尾组织经ＰＣＲ方祛鉴定转基因整合鼠，取整合鼠的子代阳性鼠的肝肾组织采用ＲＴ—ＰＣＲ方法进行ｍＲＮＡ表达鉴定，同时取其心、肝及肾组织进行荧光素酶活性检测。结果 共有１３只Ｇ０代阳性整台鼠，整合率为１９．２％；有３只整合鼠后代的肝肾组织中有ｍＲＮＡ表达；有１个转基因小鼠系心、肝、肾组织中显示荧光素酶活性。该系小鼠在外形、生长速度及繁育方面与正常小鼠无异。结用 ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ转基因小鼠模型的初步建立提示ＣＭＶ启动子启动转录的ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ－荧光素酶融合基因构件在转基因小鼠体内能够表达，这为ＨＣＶ ５＇ＮＣＲ转基因小鼠模型的进一步研究奠定了基础。

Human DNA contains sequences homologous to the 5'-non-coding region of hepatitis C virus: characterization with restriction endonucleases reveals individual varieties

Objective To investigate a 272 base pair section of the 5' non coding region of genomic DNA from the peripheral blood monounuclear cells of healthy hepatitis virus C (HCV) negative human subjects (not patients) Mothods This sequence section bears interest because ① it harbors several potential methylation (Cp rich) sites, and ② it represents the largest part of its internal ribosomal entry site A pre PCR digestion protocol was established making consistent use of four restriction endonucleases selected for certain features: SmaI, XmaCI, MspI, and HpaII are inhibited if methylation(s) are present at certain cytosines within their cutting sequences Results The suspected HCV specific sequence was found in the DNA of each subject tested The pre PCR digestion assay reveals individual differences in their pattern of methylation, which may be due to possible epigenetic phenomena Conclusions The results provide formal proof that these HCV specific sequences are contained in the genomic or extra chromosomal target DNA, and probably belong to a new class of endogenous sequences

DNA sequences homologous to hepatitis C virus(HCV) in the extrachromosomal circular DNA in peripheral blood mononuclear cells of HCV-negative subjects

Objective: This study aimed to investigate DNA sequences that are substantially homologous to the corresponding RNA sequence sections of the hepatitis C virus (HCV). These DNA sequences are present in the whole DNA extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of HCV-negative subjects. We presumed that these experimentally proven 5'-noncoding region (5'-NCR) homologous DNA sequences could be contained in the extrachromosomal circular DNA (eccDNA) fraction as part of the whole cellular DNA. Methods: Home-made polymerase chain reaction (PCR) with whole cellular and isolated eccDNA, nucleotide basic local alignment search tool (BLASTn) alignments, and tests for patterns of methylation in selected sequence sections were performed. Results: The PCR tests revealed DNA sequences of up to 320 bp that broadly matched the corresponding sequence sections of known HCV genotypes. In contrast, BLASTn alignment searches of published HCV 5'-NCR sequences with human genome databases revealed only sequence segments of up to 36 bp of the 5'-NCR. The composition of these sequences shows missing base pairs, base pair mismatches as well as complete homology with HCV reference sequences. These short sequence sections are present in numerous copies on both the same and different chromosomes. The selected sequence region within the DNA sequences of the 5'-NCR revealed a broad diversity of individual patterns of methylation. Conclusions: The experimental results confirm our assumption that parts of the HCV 5'-NCR genomic RNA sequences are present at the DNA level in the eccDNA fraction of PBMCs. The tests for methylation patterns therein revealed individual methylomes which could represent an epigenetic feature. The respective sequence section might be subject to genetic regulation.

基于膜显色结果判读的基因芯片快速检测丙型肝炎基因型方法的研究

目的 研制一种新型基于膜显色的芯片,用于丙型肝炎病毒(HCV)及其基因分型的快速检测。方法 根据HCV 5′端非编码区(5′NCR)设计特异型探针和引物,制作DNA芯片。实验组为60份HCVRNA阳性血清,对照组为20份健康人血清。获得目的片段后与芯片杂交,通过尼龙膜上的显色信息判读基因型。同时以测序法进行双盲HCV基因分型对照检测。 结果 实验组HCV芯片检测结果均为阳性,对照组均为阴性。实验组基因分型检测结果与测序结果两者符合率为96.7％。 结论 用DNA芯片来检测HCV基因分型具有快速、高特异性和高灵敏度的特性,可以应用于HCV及其基因分型临床检测。

广州地区手足口病爆发流行的分子流行病学和气象学研究（英文）

目的手足口病是2~5岁儿童常见的感染性疾病,近年来在亚太地区多次爆发流行,死亡率较高,本研究的目的是分析2008年广州地区爆发流行的手足口病的病毒分子流行病学及其与气象变量之间的关系。方法从互联网收集气象资料,收集466例疑似手足口病患儿的咽拭子标本,扩增人肠道病毒5′端非编码区,PCR产物测序并在Genbank中BLAST分析,分析肠道病毒基因型。结果成功从临床咽拭子标本中扩增了5′-NCR用于基因分型。从466例临床标本中扩增出165例阳性标本,获得12种肠道病毒类型：77例（46.67%）EV-71,37例（22.42%）CVA16,31例（18.79%）CV-A4,20例其它型别。EV-71和CV-A16是本次流行的主要病原。手足口病总发病率与CVA16和EV-71显著相关。手足口病发病率与疾病症状出现前7天的最高气温（P=0.00）、平均温度（P=0.001）和平均湿度（P=0.017）显著相关。结论 5＇-NCR测序是手足口病病原体基因分型和监测的敏感、简单、早期、快速的检测方法,EV-71和CV-A16是本次手足口病爆发的重要肠道病毒。气象变量包括最高温度、平均气温、相对湿度明显与手足口病发病率相关,在时间上滞后一周,这可作为手足口病暴发监测的潜在指标指导卫生决策。