5-Aza-dC对恶性黑色素瘤细胞的抑制作用及机制研究

目的研究5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖、凋亡及体外迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响及其作用机制。方法2022年1月至6月,通过CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验及流式细胞术检测5-Aza-dC对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞体外增殖、迁移、侵袭及凋亡等恶性生物学行为的影响;蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及缝隙连接蛋白Cx43的表达水平。采用Mann-Whitney U检验、Welch检验和单因素方差分析。结果CCK-8实验结果显示:与空白对照组及DMSO对照组相比,5-Aza-dC给药组细胞存活率均明显降低(均P<0.01);同一药物浓度作用下不同给药时间细胞存活率对比显示,细胞存活率随着作用时间的增加而降低(P<0.01)。细胞划痕实验结果显示:5-Aza-dC给药组细胞划痕愈合率均明显低于空白对照组[(74.67±11.91)%比(100.00±0.00)%,P<0.01]。Transwell侵袭实验结果显示:空白对照组侵袭细胞数量明显多于5-Aza-dC给药组[(444±65)个比(2±1)个],差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术(Annexin V/PI双染法)结果显示:5-Aza-dC给药组细胞凋亡率高于空白对照组[(11.35±0.66)%比(2.51±0.04)%],差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示:与空白对照组比较,5-Aza-dC给药组Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Cx43蛋白表达增强。结论5-Aza-dC可以促进小鼠恶性黑色素瘤B16细胞凋亡,抑制其增殖活力及迁移、侵袭能力,从而发挥抗肿瘤作用,其抑制作用可能与上调Cx43蛋白表达相关。

5-aza-dc和TSA对广西陆川猪体细胞核移植的影响

为探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc、去乙酰基转移酶抑制剂TSA对广西陆川猪体细胞核移植效率的影响,用5-aza-dc、TSA处理供体细胞和重构胚。结果显示,5-Aza-dc联合TSA处理供体细胞、重构胚以及连续处理供体细胞和重构胚,桑椹胚率均显著高于对照组(P<0.05),但各组间囊胚率差异不显著。说明5-aza-dc联合TSA处理供体细胞和克隆胚能提高猪克隆胚的发育能力,尽管差异不显著。

5-aza-dC体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞的研究

为探讨DNA甲基化水平变化与BMSCs分化的关系,采用MTT法检测不同浓度的DNA甲基化抑制剂5-aza-dC作用不同时间对细胞活力的影响,用1.0μmol·L-1的5-aza-dC处理BMSCs,并联合DMSO、尼克酰胺诱导BMSCs向胰岛细胞分化,与未作DNA酶甲基化抑制剂处理的DMSO法诱导组进行双硫腙染色对比、胰岛关键调控基因PDX-1的免疫细胞化学荧光染色鉴定对比。研究表明,0.2~1.0μmol·L-15-aza-dC为处理兔BMSCs合适的浓度,1.0μmol·L-1的5-aza-dC与DMSO、尼克酰胺诱导剂的联合使用,能够促进胰岛调控关键基因PDX-1的表达,建立了BMSCs向胰岛细胞分化的较为高效的诱导体系。揭示了甲基化程度影响BMSCs向胰岛细胞的分化,低甲基化程度促进胰岛特异基因PDX-1的表达。

FUT4-siRNA增强5-aza-dC对鳞癌细胞增殖和迁移的抑制

岩藻糖基转移酶IV(fucosyltransferase IV,FUT4)是催化蛋白质岩藻糖基化的关键酶.已经证明,FUT4-siRNA能够抑制鳞癌细胞的增殖.5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-d C)是临床常用化疗药物,但5-aza-d C是否对鳞癌有治疗作用,以及与FUT4-siRNA联合使用能否加强对鳞癌细胞增殖和迁移的抑制尚不清楚.本研究以鳞癌细胞系A431和SCC12为对象,探讨5-aza-d C及其与FUT4-siRNA联合使用对细胞增殖和迁移的影响.MTT结合流式细胞周期分析显示,5-aza-d C处理A431和SCC12细胞4 d后,细胞增殖被明显抑制,抑制率分别为18%和20%(P<0.05);与对照组比较,加药处理组G1期细胞数量减少,S期细胞数量明显增加.Western印迹结果揭示,A431细胞FUT4表达水平较SCC12细胞高.经5-aza-d C处理后SCC12细胞FUT4表达有所增加,但仍低于A431细胞中的表达.FUT4-siRNA转染结合台盼蓝活细胞记数证明,FUT4-siRNA明显降低细胞FUT4表达,5-azad C处理同时转染FUT4-siRNA的A431和SCC12细胞增殖进一步被抑制,抑制率分别为54%和60%(P<0.05).细胞划痕法显示,5-aza-d C与FUT4-siRNA联合使用,对细胞迁移能力的抑制作用比5-aza-d C单独使用增强.上述结果提示,5-aza-d C通过诱导细胞S期阻滞抑制鳞癌细胞增殖,FUT4-siRNA与5-aza-d C联合使用可加强对细胞增殖和迁移的抑制.

5-Aza-dc对宫颈癌细胞系FAM9C基因表达及甲基化影响

目的探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-Aza-dc)对宫颈癌细胞系抑癌基因FAM9C表达及甲基化状态的影响。方法常规培养高危型人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski和HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A,分别用5、10、15μmol/L的5-Aza-dc作用3、5、7d,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测FAM9C基因表达,甲基化特异性PCR(MSP)方法检测基因启动子区甲基化状态。结果未经5-Aza-dc处理的HPV阳性宫颈癌细胞系FAM9C基因呈低表达,基因启动子区表现为完全甲基化状态;未经5-Aza-dc处理的HPV阴性宫颈癌细胞系FAM9C基因表达水平较高,基因启动子区呈不完全甲基化和非甲基化状态。10或15μmol/L的5-Aza-dc作用5d时,HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski的FAM9C基因表达显著上调,基因启动子区由完全甲基化转变为不完全甲基化和非甲基化状态;HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A应用5-Aza-dc处理前后FAM9C基因表达及启动子区甲基化状态无明显变化。结论 HPV诱导异常甲基化可能是宫颈癌细胞系FAM9C基因表达降低甚至沉默的主要原因;甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc能逆转FAM9C基因甲基化状态,使该基因重新表达。

5-aza-dc对延边奶山羊耳成纤维细胞生物学特性的影响

通过DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dc对延边奶山羊耳成纤维细胞进行不同处理后,利用MTT比色法选定5-aza-dc的最适作用浓度和时间,用Hochest33342/PI双染和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况,通过核型分析检测5-aza-dc对细胞染色体的影响。结果表明,低浓度的5-aza-dc(≤0.010μmol/L)作用72 h对细胞影响不大;随其浓度的增加,细胞形态、活率、凋亡及染色体都受到显著影响。5-aza-dc对细胞的最佳处理时间为72 h,此时低浓度的5-aza-dc并未引起细胞凋亡和核型改变。

5-Aza-dC在肺癌细胞系中去甲基化作用机制

目的研究5-Aza-d C对肺癌细胞系中的去甲基化的作用。方法对正常肺细胞以及5-Aza-d C分组处理的A 549、NCI-H 520甲基化特异性PCR和RT-PCR定量检测。结果未处理的A 549和NCI-H 520细胞中TFPI-2表现出完全甲基化特异性。而经过5-Aza-d C处理过的肺癌细胞系细胞则表现出不完全甲基化状态,并呈现出量效关系。A 549和NCI-H 520细胞在经5-Aza-d C处理后TFPI-2基因m RNA表达均明显高于未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);并呈现出量效关系。结论 5-Aza-d C对肺癌细胞中的TFPI-2基因具有去甲基化作用,并具有量效关系。

5-aza-dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza-dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20 nM(72 h)5-aza-dC和50 nM(12 h)TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-aza-dC+TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-aza-dC+TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率(P<0.01)。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。

5-Aza-dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中hMLH-1基因表达的影响

目的:探讨5-Aza-dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中抑癌基因基因表达的影响。方法:5-Aza-dC及TSA处理体外培养的人小细胞肺癌细胞系NCI-H446,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测人小细胞肺癌细胞系NCI-H446药物干预前后抑癌基因hMLH-1表达情况的变化。结果:NCI-H446细胞系经TSA,5-Aza-dC及联合作用后使原来不表达的抑癌基因hMLH-1重新表达或表达增强。结论:hMLH-1基因的异常甲基化是肺癌发生、发展过程中的频繁事件。肺癌细胞系中抑癌基因hMLH-1启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因,5-Aza-dC单独作用和5-Aza-dC及TSA联合应用效果相似,均能显著增强甲基化的肿瘤抑制基因的重新表达。

5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌细胞株中3-OST-2甲基化和基因表达的影响

目的探讨5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中3-OST-2甲基化水平、基因表达以及对核转录因子UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1,也称为ICBP90/NP95)表达的影响。方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法检测药物作用前后HCC细胞株中3-OST-2甲基化的状态改变;采用实时荧光定量RT-PCR法检测3-OST-2和UHRF1 mRNA的表达变化;采用细胞爬片免疫组化法检测UHRF1蛋白表达。结果 3-OST-2在HCC细胞株中呈完全甲基化状态,5-Aza-dC或TSA均能部分逆转3-OST-2甲基化,其mRNA表达分别增加2.7倍和4.9倍,两种药物联合处理后,3-OST-2甲基化被完全逆转,其mRNA表达增加9.1倍。5-Aza-dC或TSA均能降低UHRF1 mRNA和蛋白的表达,TSA比5-Aza-dC疗效更好(P<0.01),两种药物联用具有协同作用(P<0.01)。结论启动子甲基化和组蛋白修饰共同导致3-OST-2基因表达降低。5-Aza-dC和TSA单独作用均能部分逆转3-OST-2甲基化,增加其mRNA表达,抑制核蛋白UHRF1表达可能是其中机制之一。

5-Aza-CdR联合EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用

目的:探讨EB病毒核抗原1(EBNA1)mRNA修饰的DC(EBNA1-DC)诱导的淋巴细胞联合甲基化抑制剂5-Aza-CdR对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用。方法:以构建的EBNA1-pCDNA3.1质粒为模板,体外转录获得EBNA1 mRNA,通过脂质体转染至健康人外周血来源DC,构建EBNA1-DC疫苗。流式细胞术检测转染后DC表型及5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况。实时无标记动态细胞分析技术检测EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞联合5-Aza-CdR的特异性抗肿瘤活性。结果:转染EBNA1 mRNA后EBNA1-DC表面EBNA1阳性率为(59.3±5.85)%,HLA-DR的表达与未转染DC相比显著升高[(84.9±5.5)%vs(68.0±5.8)%,P=0.026],CD80的表达也显著升高([88.2±3.9)%vs(61.1±4.4)%,P=0.015]。低剂量5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况与未处理的细胞相比无显著差异。经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞中IRF7基因表达与未处理的细胞相比显著升高(P=0.0001)。与空载的DC相比,EBNA1-DC诱导的淋巴细胞对EBV阳性表达的C666-1细胞具有更强的特异性杀伤活性(P=0.049);经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞对EBNA1-DC诱导的特异性免疫杀伤更敏感(P=0.019)。结论:5-Aza-CdR与EBNA1-DC疫苗联合可显著增强对C666-1细胞的特异性免疫杀伤,本研究为开拓以mRNA为基础的DC疫苗及其在临床综合治疗中的应用转化提供前期研究基础。

5-Aza-dC对胰腺癌细胞系Panc-1中TFPI-2基因甲基化水平及表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-A2a-dc)对胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)甲基化水平及基因表达的影响。方法用不同浓度5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系Panc-1。用甲基化特异性PCR(MS-PCR),反转录聚合酶链(RT-PCR)及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后Panc-1细胞TFPI-2基因的甲基化状态,mRNA及蛋白表达的改变。结果 MSP检测Panc-1细胞TFPI-2基因药物作用后异常甲基化得到逆转,RT-PCR检测到不同浓度5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA重新表达,相对表达量分别为(0.211±0.087),(0.327±0.068),(0.609±0.017),Western blot检测TFPI-2基因蛋白重新表达,相对表达量分别为(0.429±0.121),(0.675±0.044),(1.132±0.124),以上作用呈时间、剂量依赖性(P<0.05),差异具有统计学意义。结论胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能够较成功的逆转胰腺癌细胞Panc-1中TFPI-2基因的高甲基化状态,并能恢复TF-PI-2基因的mRNA及蛋白重新表达。

紫杉醇联合5-Aza-dC对非小细胞肺癌细胞NCI-H446生长抑制作用的研究

目的探讨紫杉醇(PAC)联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-d C)对非小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖迁徙及侵袭能力的影响。方法将人小细胞肺癌细胞NCI-H446给予紫杉醇及5-Aza-d C干预处理,根据药物干预方式的不同分为对照组、紫杉醇组及联合用药组;应用CCK-8法检测各组NCI-H446细胞增殖能力的差异;划痕实验和Transwell实验检测各组NCI-H446细胞迁移和侵袭能力的差异。结果 CCK-8结果显示PAC及5-Aza-d C均可抑制NCI-H446细胞的增殖活性,且呈时间依赖性。48 h后紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的增殖能力较对照组明显减弱(P<0.01);划痕实验结果显示划痕形成24 h后,对照组划痕愈合率为(69.15±0.837)%。而在紫杉醇组划痕处愈合率为(47.30±0.783)%;联合用药组划痕愈合率为(43.45±0.862)%。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞在迁移能力方面较对照组差异有统计学意义(P<0.01);Transwell实验结果显示对照组NCI-H446细胞转染穿过基质胶的细胞数量为(151.4±6.88)个,紫杉醇组为(66.8±5.17)个,联合用药组为(40.2±4.55)个。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的侵袭能力较对照组差异有统计学意义(P<0.01)。结论 5-Aza-d C作为化疗增敏剂可增加非小细胞肺癌细胞NCI-H446对紫杉醇的敏感性,从而提高紫杉醇对非小细胞肺癌的化疗效果。

5-杂氮脱氧胞苷逆转膀胱癌T24细胞死亡相关蛋白激酶的转录表达

目的研究膀胱癌细胞T24中死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子区的甲基化状态,探讨使用5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)处理T24细胞后对DAPK转录表达的影响及其细胞生物学效应。方法使用不同浓度去甲基化药物5-aza-dc处理膀胱癌细胞株T24后,使用MTT法、流式细胞仪分别检测5-aza-dc对T24细胞的增殖抑制作用及凋亡率。应用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK启动子区甲基化状态的变化情况。应用RT-PCR、Western-blotting分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK转录、表达的变化情况。结果MTT法显示不同浓度5-aza-dc对T24细胞有明显的增殖抑制作用,流式细胞仪检测T24细胞的最大凋亡率为(24.12±1.4)%。正常培养条件下T24细胞中DAPK启动子区出现高甲基化且DAPKmRNA无表达,在5-aza-dc(12.5μmol/L)作用24h后,T24细胞中DAPK启动子区恢复为未甲基化状态且DAPKmRNA及蛋白重新恢复表达。结论膀胱癌细胞株T24中DAPK启动子区高甲基化可能是抑制其转录表达的重要原因;5-aza-dc可以通过去甲基化作用使DAPK恢复表达,从而抑制T24细胞的增殖并诱导细胞凋亡。5-aza-dc有望成为膀胱癌化疗的有效药物。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对宫颈癌细胞的基因表达调控

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-d C)对宫颈癌细胞p16和MGMT基因表达的调控作用。方法:用5-Aza-d C处理4种宫颈癌细胞(He La、Si Ha、C33A和Ca Ski)后,MSP检测抑癌基因P16和MGMT的甲基化变化,并用荧光定量PCR和Western blot检测P16和MGMT的表达情况,同时用MTT和Annexin V-FITC/PI双染检测细胞增殖和凋亡。结果 :P16和MGMT在4种宫颈癌细胞中均存在甲基化。用5-Azad C处理细胞后,甲基化程度均被逆转。5-Aza-d C抑制P16和MGMT在宫颈癌细胞中的表达。5-Aza-d C抑制宫颈癌细胞的增殖并促进其凋亡。结论:P16和MGMT虽在宫颈癌细胞中存在甲基化,但其表达程度仍然较高,推测P16和MGMT的表达调控可能还受其他因素的影响。5-Aza-d C能抑制宫颈癌细胞的生长。5-Aza-d C虽然可以使宫颈癌细胞中P16和MGMT的甲基化程度得到逆转,但对P16和MGMT的表达却是抑制的,尚需更多实验验证并发掘其原因及机制。

5-Aza-2′-dC通过上调DR4与DR5表达增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性

目的探讨5-Aza-2′-dC增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导乳腺癌细胞凋亡敏感性的作用及其可能机制。方法 5μmol/L 5-Aza-2′-dC预处理细胞96 h,TRAIL(0,50,100,200 ng/mL)处理细胞12 h,MTT检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,流式细胞技术检测TRAIL受体DR4及DR5的表达,Western blot检测caspase-8蛋白表达水平,Real-time PCR检测细胞DR4、DR5和caspase-8 mRNA表达。结果 5-Aza-2′-dC预处理组与对照组相比,TRAIL对细胞增殖抑制率和诱导凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。5-Aza-2′-dC能增加细胞表面DR4和DR5表达,促进凋亡通路关键蛋白caspase-8活化。5-Aza-2′-dC在mRNA水平增加了DR4、DR5和caspase-8的表达。结论 5-Aza-2′-dC增加了TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性,其可能机制是通过上调DR4、DR5和caspase-8表达实现。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对腺样囊性癌细胞RECK基因表达及细胞侵袭力的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine,5-aza-d C)对腺样囊性癌细胞中RECK基因表达及肿瘤侵袭力的影响。方法:采用甲基化特异性PCR、实时定量PCR、Western印记检测腺样囊性癌细胞中RECK基因的甲基化状态及RECK基因mRNA和蛋白的表达,transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果:RECK基因甲基化条带仅在ACC-M细胞中发现,经5-aza-d C处理后ACC-M细胞中RECK基因甲基化得到逆转,RECK基因mRNA及蛋白的表达显著提升。ACC-M细胞的侵袭力明显降低。结论:5-aza-d C可逆转腺样囊性癌ACC-M细胞中RECK基因的高甲基化状态并恢复RECK基因mRNA及蛋白的表达,抑制ACC-M细胞侵袭力。

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中Wif-1基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza-CdR)对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化水平及蛋白表达的影响。方法用不同浓度(0.5、1.0、1.5μmol/L)5'-Aza-CdR处理结直肠癌细胞株HT-29和LoVo。应用TaqMan探针为基础的实时定量PCR(Methylight)方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中Wif-1基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。结果 Methylight检测HT-29和LoVo细胞中Wif-1蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-Aza-CdR处理后Wif-1基因mRNA和蛋白重新表达,实时荧光定量PCR检测DMSO对照组和不同浓度5'-Aza-CdR(0.5、1.0、1.5μmol/L)在HT-29细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000)、(1.207±0.052)、(1.790±0.033)和(2.016±0.123);在LoVo细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000)、(1.294±0.048)、(1.893±0.061)和(2.204±0.041)。Western blot检测Wif-1蛋白检测DMSO对照组和不同浓度5'-Aza-CdR在HT-29细胞株相对表达量分别为(0.456±0.040)、(0.511±0.025)、(0.857±0.031)和(0.934±0.047);LoVo细胞株相对表达量分别为(0.842±0.032)、(0.844±0.044)、(0.854±0.037)和(0.856±0.034)。以上作用均呈时间、剂量依赖性,Wif-1基因mRNA在HT-29细胞株表达和LoVo细胞株表达差异均有高度统计学意义(F=144.823,P=0.000;F=476.195,P=0.000)。Wif-1蛋白表达在HT-29细胞株表达差异有高度统计学意义(F=129.674,P=0.000),但Wif-1蛋白表达在LoVo细胞株表达差异无统计学意义(F=0.117,P=0.948)。结论结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能够较成功地逆转结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

5-氮脱氧胞苷及曲古抑菌素A影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性及浓度依赖性

目的:探讨甲基转移酶抑制剂——5-氮脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dC)和组蛋白去乙酰基酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性和浓度依赖性。方法:用不同浓度5-aza-dC及TSA按不同作用时间处理供核细胞(鼠尾尖成纤维样细胞),利用实时定量PCR法检测处理后H19基因的表达。结果:不同浓度的5-aza-dC处理组之间H19的表达无明显差异,但延长作用时间可使H19表达增强;TSA使H19的表达下降,但无时间依赖性。结论:长时间低浓度的5-aza-dC能增强供核细胞中H19基因的表达,而TSA则使H19的表达减弱,为体细胞克隆中表观遗传修饰抑制剂的选择及后续基因印迹研究提供了依据。

5-Aza-2'-dc预处理致敏百草枯对V79细胞活性氧及Bcl-2/Bax表达的影响

目的研究DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-dc)与百草枯联合对V79细胞作用后的活性氧含量及抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白表达的影响.方法 V79细胞经传代培养后分为5-Aza-2'-dc作用组(A组)、百草枯作用组(B组)、5-Aza-2'-dc加百草枯作用组(C组,即先应用5-Aza-2'-dc对V79细胞进行预处理12h,然后给予百草枯作用12h)、对照组(D组).采用2,7二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针装载,流式细胞仪测定各实验组V79细胞内活性氧含量,Western blot检测各实验组V79细胞内抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白的表达情况.结果 5-Aza-2'-dc与百草枯联合作用组(C组)V79细胞内活性氧含量、抗凋亡Bcl-2蛋白、促凋亡Bax蛋白表达与5-Aza-2'-dc组(A组)、百草枯组(B组)和对照组(D组)比较有统计学差异(P<0.05);C组V79细胞内抗凋亡Bcl-2蛋白表达、抗凋亡Bcl-2蛋白/促凋亡Bax蛋白比值降低,活性氧含量和促凋亡Bax蛋白表达升高.结论 5-Aza-2'-dc调控DNA甲基化可能通过活性氧代谢失衡、细胞调亡来促进百草枯对V79细胞的毒性损伤.