铜绿假单胞菌寡核苷酸酶的纯化、结晶和活性验证

目的:研究致病菌铜绿假单胞菌寡核苷酸酶(PaOrn)的三维结构和体外水解活性,验证PaOrn活性位点并探讨PaOrn对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)胞内3',5'-环二鸟苷(c-di-GMP)水平和致病毒性的影响。方法:构建重组质粒pET 32M3C-PaOrn,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达目的蛋白,获得组氨酸(His)标签和谷胱甘肽(GST)标签标记。采用多级纯化方法纯化蛋白,经Ni亲和层析、GST亲和层析和阴离子交换层析后获得高纯度和高均一性PaOrn目的蛋白。采用商业化结晶试剂和坐滴法筛选晶体,根据晶体状态进一步优化。采用X射线衍射法验证晶体质量,分辨率高于3Å时用于结构解析。采用高分辨质谱技术Q TOF验证PaOrn蛋白水解底物二鸟苷磷酸(pGpG)活性,鸟苷单磷酸(GMP)产物作为验证活性的指标。采用尿素聚丙烯酰胺(Urea-PAGE)法验证PaOrn蛋白和点突变PaOrn蛋白(Orn^(D11A)、Orn^(E13A)、Orn^(D111A)、Orn^(H157A)和Orn^(D162A))对10 nt长度寡核苷酸RNA的水解活性,降解条带作为活性正常的分析指标。结果:经原核系统表达和多级纯化,得到纯度高达95%的目的蛋白PaOrn。于结晶试剂WizardⅠ#12[1.0 mmol·L^(-1)(NH4)2HPO4,0.1 mmol·L^(-1) Imidazole]pH 8.0条件下生长出质量较好的单晶,晶体PaOrn的分辨率为1.85Å,复合物PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG的分辨率分别为1.90Å和1.70Å。高分辨质谱,PaOrn将底物pGpG水解为GMP。尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳,PaOrn可降解长达10 nt的RNA,当活性位点Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162分别突变后,PaOrn丧失活性,无法降解底物pGpG和RNA(10 nt)。结论:PaOrn通过降解寡核苷酸参与调控胞内c-di-GMP和RNA水平,影响转录起始和细胞多种生物学行为。