番茄环斑病毒5’RNA1保守片段的克隆及病毒检测

提取感染番茄环斑病毒TomatoRingspotNepovirus(TomRSV)的番杏 (TetragoniaExpansa)和葡萄品种赤霞珠(Vitis.cv.CabernetSauvignon)嫩叶及其阴性对照的总RNA ,根据NCBI中报道的TomRSV病毒四个分离物RNA15’端保守片段设计引物 ,对提取的总RNA进行RT -PCR扩增 ,获得长 4 5 0bp特异性片段 ,并克隆到PMD18-T载体中构建PT -TomRSV重组载体。以PT -TomRSV载体为阳性对照 ,以无毒赤霞珠叶片为阴性对照 ,对带毒赤霞珠葡萄叶片作番茄环斑病毒巢式PCR检测。

lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭

目的研究长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1(lncRNA DLX6-AS1)对皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭的影响及潜在机制。方法以双荧光素酶报告系统实验验证lncRNA DLX6-AS1与miR-16-5p、miR-16-5p与核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1(NUCKS1)mRNA的靶向结合。通过单独或联合转染lncRNA DLX6-AS1抑制物(si-DLX6-AS1)、miR-16-5p抑制物(anti-miR-16-5p)、NUCKS1抑制物(si-NUCKS1)和相应对照(DLX6-AS1-NC、anti-miR-NC、NUCKS1-NC)调控A431细胞目的基因的表达,采用qRT-PCR检测A431细胞lncRNA DLX6-AS1、miR-16-5p、NUCKS1 mRNA的表达;Western印迹检测NUCKS1、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗体、基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9蛋白水平;CCK8实验检测细胞存活率;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。两组间比较采用独立样本t检验。结果双荧光素酶报告系统实验显示,lncRNA DLX6-AS1靶向结合miR-16-5p,miR-16-5p靶向结合NUCKS1。si-DLX6-AS1组A431细胞miR-16-5p表达水平(3.01±0.31)高于DLX6-AS1-NC组(1.02±0.10,t=18.33,P<0.001);NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于DLX6-AS1-NC组(均P<0.05),细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于DLX6-AS1-NC组(均P<0.05)。si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组(均P<0.05),细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于NUCKS1-NC组(均P<0.05)。低表达lncRNA DLX6-AS1后,anti-miR-16-5p组A431细胞miR-16-5p表达(0.34±0.04)低于anti-miR-NC组(1.00±0.12,t=15.65,P<0.05),Cyclin D1、MMP2和MMP9相对表达水平均高于anti-miR-NC组(均P<0.05),细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均高于anti-miR-NC组(均P<0.05)。低表达lncRNA DLX6-AS1、敲减miR-16-5p后,si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组(P<0.05),细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均低于NUCKS1-NC组(P<0.05)。结论lncRNA DLX6-AS1可通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控A431细胞增殖、迁移和侵袭,lncRNA DLX6-AS1可能是治疗皮肤鳞状细胞癌的潜在分子靶点。