牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板 ,参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物 ,PCR扩增获得长度为 931bp ,包括 5′端侧翼 797bp和结构基因第一外显子区 134bp的牛FSHR基因片段。将该片段克隆于PUC18载体中 ,作序列分析发现 :牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同 ,它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点 ,牛与绵羊在 5个序列位点有碱基变异 ,这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关。对 34头份中国西门塔尔牛的扩增产物 ,应用PCR RFLP方法进行多态性分析 ,TaqⅠ酶切出现了多态性 ,酶切产物电泳呈现 3种基因型 ,由 2种等位基因构成。通过对基因频率和基因型频率在种用公牛、双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果 ,认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。

橡胶树延伸因子cDNA及其5′端启动子区域序列的分离与分析

橡胶延伸因子 REF(Rubber Elongation Factor)是橡胶生物合成中最重要的酶之一 ,是胶乳中主要的蛋白质。作者利用已发表的 REF c DNA序列设计并合成引物。通过提取胶乳总 RNA用 RT法合成 c DNA后 ,通过 PCR技术扩增并克隆了 REF c DNA序列。序列测定结果表明 ,所克隆的 REF c DNA编码区序列全长 4 14个碱基 ,编码 138个氨基酸 ,3′端非编码区长 112 bp。与 Goyvaerts E等人发表的序列比较 :REF c DNA编码区序列同源率为 10 0 % ,3′端非编码区有 2 bp的差异 ,同源率为 98%。在此基础上 ,通过步移法分离 5′端启动子区域 2 6 0 bp的序列 ,其中 ,含典型的TATA盒和 CAAT盒。为证实该基因为乳管特异表达 ,我们通过 Northern blot对橡胶延伸因子基因在胶乳和叶片中的表达做分析。初步结果表明 ,橡胶延伸因子基因主要在胶乳中表达。

柞蚕丝素基因5′端部分序列的克隆及结构分析

利用PCR技术从中国柞蚕品种 74 1中扩增并克隆出柞蚕丝素基因 5′端部分片段 ,它由CAAT盒、TATA盒 (Hognessbox)、primtranscript、丝素蛋白的起始密码子ATG和部分结构基因及内含子组成。通过与天蚕丝素基因的 5′端序列进行比较 ,发现 12 4～ 5 0 6bp、796～ 1194bp、12 16～ 12 98bp同源性高 ,同源率分别为91.6 %、95 %、95 %。将柞蚕丝素基因 5′端的CAAT盒、TATA盒、primtranscript序列与KikuchiY所测家蚕、HuiCC所测家蚕及家蚕P2 5蛋白、天蚕丝素基因相应序列进行比较 ,发现柞蚕与天蚕相应序列的同源率远高于家蚕。从序列中可以看出 :若转录起始点第一个核苷酸标为 +1,则TATA盒位于 - 2 5处 ;CAAT盒位于 - 70处。

猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67^+1与-97^-59区段。在5′UTR转录调控区(-428^+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株 5′端非编码区序列与生物特性的关系 ,从而为疫苗研制打下基础 ,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT PCR扩增 ,克隆法测序。结果表明 :森张株 5′ UTR长 12 9nt,与Sofjin HO、Os hima5 10、Vasilchenko、Neudoerfl、2 6 3、Hypr的同源性分别为 92 %、91%、89%、87%、87%、87%。森张株存在三处特异性变异C18→T、T3 0 →C及 4 9、5 0连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似 5′端非编码区序列测定方法 ;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录。

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)5′端非编码区基因的克隆及序列分析

为了探讨家蚕传染性软化病病毒的复制与翻译机制,利用cDNA 5′末端快速扩增(5′-RACE)技术获得了家蚕传染性软化病病毒桐乡分离株(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV-2)的5′端非编码区(non-coding region,NCR)。序列比较分析发现:BmIFV-2的5′-NCR由155个核苷酸组成,A+U含量达60.64%,其中包含1个起始密码子AUG;与坂城分离株(BmIFV-1)的5′-NCR相比,BmIFV-2的5′-NCR在5′末端缺少1个核苷酸,但核苷酸识别率为100%(即单核苷酸变异率为0),而且这个缺少的核苷酸并不影响其5′-NCR的二级结构。与已经证实具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)活性的Iflavirus属的2种病毒EoPV(Ectropis obliquapicor-na-like virus)和VDV-1(Varroa destructorvirus 1)的5′-NCR相比,BmIFV的5′-NCR可能也具有IRES活性。

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG)。

杂鳞库蚊复组28S rRNA基因5′端序列研究

对我国三带喙库蚊、环带库蚊和伪杂鳞库蚊共计79只蚊虫的28SrRNA基因5′端序列进行测定,获得的序列长度为301bp,3蚊种的该段序列相同。为设计杂鳞库蚊复组近缘种的PCR鉴别方法打下基础。

Sabin1型脊髓灰质炎病毒在人二倍体细胞适应过程中5′端非编码区序列变异与滴度的关系

目的 探索Sabin 1型脊髓灰质炎病毒在人胚肺二倍体细胞适应过程中 5′端非编码区序列变异及其与病毒感染性滴度的关系。方法 将Sabin 1型脊髓灰质炎病毒疫苗株在人胚肺二倍体细胞KMB17中连续传 11代 ,检测连续传代后感染性滴度 ,并检测 11个代次 5′端非编码区序列。结果 随着传代次数的增加 ,感染性滴度逐渐升高 ,在第 7代达到最高 ,为8 12 5LgTCID50 ml。在传代过程中 ,从第 3代起 5′端非编码区 74 2个核苷酸只出现 1个位点发生变异 ,第 6 39位由A变为G。结论 Sabin 1型脊髓灰质炎病毒经KMB17细胞传 11代 ,已适应KMB17细胞。Poliovirus 5′端非编码区与毒力直接相关的第4 80位核苷酸未发生回复突变。

深圳地区手足病肠道病毒5′端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的 :分析深圳地区手足口病病人肠道病毒 (EV) 5′端非编码区 (5′UTR)部分基因序列 ,了解本地区手足口病病人EV感染的基因型。方法 :设计特异性引物 ,建立检测EV的RT PCR方法 ,对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和 /或咽拭子、脑脊液标本进行检测 ,并对 5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定。结果 :分离出的 5株EV 5′UTR基因的核苷酸同源性为 85 .5 %～ 99.3% ,与EV71BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB3同源性为 86 .3%～ 93.3%。结论 :深圳地区手足口病EV 5′UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高 ,提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染。

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

To investigate the adaptation of poliovirus Sabin 2 in human embryonic lung diploid fibroblast（KMB17） and its relation to nucleotide mutations of 5′ noncoding region（5′NCR）,the Sabin 2 vaccine virus was passaged serially in KMB17 for seventeen passages.The infectious titers of Sabin 2 virus increased along with the passages,the highest titer reached 8.0 LgCCID50/ml at passage 13（P13）.During passage,there were three nucleotide mutations appeared in 5′NCR,G changed to C at position 20,C to U at position 189 and G to A at position 481.The results showed that Sabin 2 poliovirus adapted well in KMB17 after 17 passages.The nucleotide mutation at position 481 that appeared from passage 3 on indicated the possibility of virulent reversion.

绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本文对绵羊 β-乳球蛋白基因 5′端及上游调控序列的 PCR方法扩增进行了研究 .经比较分析 ,将从羊血中提取的绵羊基因组 DNA的模板用量定为 4μl( 0 .4μg/μl) ,Taq DNA聚合酶用量为 0 .83μl( 3u/μl) ,变性为 94℃ 1 min,退火为 64℃ 1 m in,72℃延伸 2 min,循环次数为32次 ,获得的 PCR产物经电泳检测 ,条带明亮 ,特异性高 ,大小为 898bp.经序列分析发现 ,与已知基因组序列一致性达 99%以上 ,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达 .

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段。通过T4DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段。经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致。

线性DNA复制后5′端空缺的填补

介绍了近年来线性DNA复制后 5′端空缺填补问题的研究进展及其在控制细胞的衰老、癌变等方面的重要作用 .对 5′端空缺填补的问题 ,认为不论何种填补方式 ,DNA都是通过特殊的末端顺序 ,在 3′端形成模板引物结构而完成空缺的填补 .

基于线粒体COI基因5′端区段粉螨DNA条形码研究

目的:基于线粒体COI基因5′端区段对常见储藏物粉螨进行分子鉴定,为粉螨鉴定方法的探讨提供依据。方法:采集储藏物样本,分离粉螨,形态学鉴定后,提取单个螨基因组DNA、PCR扩增、克隆测序,所获序列在Blast中进行同源性比对。结合GenBank已知粉螨COI基因序列,用ClustalX 1.83软件进行多序列比对,基于MEGA X软件进行序列分析并计算遗传距离,构建Maximum Likelihood系统发育树。结果:经形态学鉴定出7种粉螨,其中腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae、范张食酪螨T.fanetzhangorum、粉尘螨Dermatophagoides farinae、棕脊足螨Gohieria fusca和害嗜鳞螨Lepidoglyphus destructor分子鉴定与形态学鉴定相一致,拱殖嗜渣螨Chortoglyphus arcuatus和纳氏皱皮螨Suidasia nesbitti分子鉴定与形态学鉴定并非一致,共检测到261个变异位点,400个保守位点,247个简约信息位点。种内遗传距离为0.00~0.01,种间遗传距离为0.171~0.262。构建ML系统进化树显示,7种粉螨均独立聚为一支,且支持率均达100%,与形态学鉴定一致。结论:线粒体COI基因5′端区段可用于7种常见储藏物粉螨的物种鉴定,为构建DNA条形码数据库提供基础资料。

黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列克隆和报告基因载体活性分析

为深入研究黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列在性别决定与分化中细胞通路之间的转录调控作用。本研究以黄鳝基因组DNA为模板,PCR扩增出Dmrt1基因5′端侧翼序列,并对该序列进行了生物信息学分析,然后将克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列构建到PGL3-enhancer载体中,命名为pGL3-enhancer-Dmrt1,最后将pGL3-enhancer-Dmrt1和内参质粒pRL-TK共转染至HEK293细胞,采用双荧光素酶检测系统对Dmrt1基因5′端侧翼的启动活性进行了检测。实验结果显示:克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列为1519 bp;利用TESS-Transcription Element Search System转录因子结合位点在线预测数据库对黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列进行预测分析结果表明,该序列存在AP-1、Oct-1、C/EBPa和GATAx等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点,如SRY、Sox3和Sox5等;双荧光素酶检测结果显示,该5′端侧翼序列具有启动活性。

HCV-5′端非编码区cDNA在大肠杆菌内的克隆

本文从本院住院病人血清中用异硫氰酸胍裂解法提取HCV RNA,采用均含有EcoRⅠ内切酶位点的内引物进行RT—PCR,得到HCV RNA 5′端144bp(核苷酸从46到219)大小的cDNA片段,用EcoR Ⅰ酶消化RT—PCR产物,再将酶切后的扩增产物纯化。

杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白的亚细胞定位及其启动子5'端缺失片段的功能分析

为了研究杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因(DDBJ,BpUGDH基因登录号为LC457701)启动子不同区域的表达活性,利用5′端缺失及同源重组实验技术,将5个不同长度的BpUGDH启动子5′端缺失片段与GUS基因连接,并通过农杆菌介导法瞬时转化烟草;同时,为了定位BpUGDH基因编码的蛋白在细胞中表达的具体位置,利用GFP报告基因融合目的基因进行蛋白质的亚细胞定位。结果显示:BpUGDH基因启动子-244 bp以内的序列均能介导GUS基因的诱导表达,并且-973、-465、-355、-281和-244 bp之间的区域可能对BpUGDH基因启动子的活性发挥着至关重要的作用。另外,BpUGDH基因编码蛋白的亚细胞定位结果显示:BpUGDH位于叶绿体中。

副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列测定及分析

目的测定副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列,分析其前导区一级及二级结构与功能的关系。方法从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增(RACE)法分别扩增基因组3′和5′端cDNA片段,并克隆至pGM-T载体中,然后分别测定插入片段的核苷酸序列,用DNAStar软件将测得的3′和5′端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对,用RNAdraw软件预测基因组3′和5′端前导区二级结构并进行比较分析。结果副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸,前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89.1%～96.4%和93.0%～96.5%,二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定。结论副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′端前导区序列相对保守,可能与病毒复制、转录调控及致病性有关。