猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67^+1与-97^-59区段。在5′UTR转录调控区(-428^+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株 5′端非编码区序列与生物特性的关系 ,从而为疫苗研制打下基础 ,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT PCR扩增 ,克隆法测序。结果表明 :森张株 5′ UTR长 12 9nt,与Sofjin HO、Os hima5 10、Vasilchenko、Neudoerfl、2 6 3、Hypr的同源性分别为 92 %、91%、89%、87%、87%、87%。森张株存在三处特异性变异C18→T、T3 0 →C及 4 9、5 0连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似 5′端非编码区序列测定方法 ;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录。

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)5′端非编码区基因的克隆及序列分析

为了探讨家蚕传染性软化病病毒的复制与翻译机制,利用cDNA 5′末端快速扩增(5′-RACE)技术获得了家蚕传染性软化病病毒桐乡分离株(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV-2)的5′端非编码区(non-coding region,NCR)。序列比较分析发现:BmIFV-2的5′-NCR由155个核苷酸组成,A+U含量达60.64%,其中包含1个起始密码子AUG;与坂城分离株(BmIFV-1)的5′-NCR相比,BmIFV-2的5′-NCR在5′末端缺少1个核苷酸,但核苷酸识别率为100%(即单核苷酸变异率为0),而且这个缺少的核苷酸并不影响其5′-NCR的二级结构。与已经证实具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)活性的Iflavirus属的2种病毒EoPV(Ectropis obliquapicor-na-like virus)和VDV-1(Varroa destructorvirus 1)的5′-NCR相比,BmIFV的5′-NCR可能也具有IRES活性。

深圳地区手足病肠道病毒5′端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的 :分析深圳地区手足口病病人肠道病毒 (EV) 5′端非编码区 (5′UTR)部分基因序列 ,了解本地区手足口病病人EV感染的基因型。方法 :设计特异性引物 ,建立检测EV的RT PCR方法 ,对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和 /或咽拭子、脑脊液标本进行检测 ,并对 5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定。结果 :分离出的 5株EV 5′UTR基因的核苷酸同源性为 85 .5 %～ 99.3% ,与EV71BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB3同源性为 86 .3%～ 93.3%。结论 :深圳地区手足口病EV 5′UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高 ,提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染。

Sabin1型脊髓灰质炎病毒在人二倍体细胞适应过程中5′端非编码区序列变异与滴度的关系

目的 探索Sabin 1型脊髓灰质炎病毒在人胚肺二倍体细胞适应过程中 5′端非编码区序列变异及其与病毒感染性滴度的关系。方法 将Sabin 1型脊髓灰质炎病毒疫苗株在人胚肺二倍体细胞KMB17中连续传 11代 ,检测连续传代后感染性滴度 ,并检测 11个代次 5′端非编码区序列。结果 随着传代次数的增加 ,感染性滴度逐渐升高 ,在第 7代达到最高 ,为8 12 5LgTCID50 ml。在传代过程中 ,从第 3代起 5′端非编码区 74 2个核苷酸只出现 1个位点发生变异 ,第 6 39位由A变为G。结论 Sabin 1型脊髓灰质炎病毒经KMB17细胞传 11代 ,已适应KMB17细胞。Poliovirus 5′端非编码区与毒力直接相关的第4 80位核苷酸未发生回复突变。

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

To investigate the adaptation of poliovirus Sabin 2 in human embryonic lung diploid fibroblast（KMB17） and its relation to nucleotide mutations of 5′ noncoding region（5′NCR）,the Sabin 2 vaccine virus was passaged serially in KMB17 for seventeen passages.The infectious titers of Sabin 2 virus increased along with the passages,the highest titer reached 8.0 LgCCID50/ml at passage 13（P13）.During passage,there were three nucleotide mutations appeared in 5′NCR,G changed to C at position 20,C to U at position 189 and G to A at position 481.The results showed that Sabin 2 poliovirus adapted well in KMB17 after 17 passages.The nucleotide mutation at position 481 that appeared from passage 3 on indicated the possibility of virulent reversion.

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段。通过T4DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段。经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致。

牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板 ,参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物 ,PCR扩增获得长度为 931bp ,包括 5′端侧翼 797bp和结构基因第一外显子区 134bp的牛FSHR基因片段。将该片段克隆于PUC18载体中 ,作序列分析发现 :牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同 ,它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点 ,牛与绵羊在 5个序列位点有碱基变异 ,这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关。对 34头份中国西门塔尔牛的扩增产物 ,应用PCR RFLP方法进行多态性分析 ,TaqⅠ酶切出现了多态性 ,酶切产物电泳呈现 3种基因型 ,由 2种等位基因构成。通过对基因频率和基因型频率在种用公牛、双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果 ,认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。

副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列测定及分析

目的测定副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端序列,分析其前导区一级及二级结构与功能的关系。方法从感染病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增(RACE)法分别扩增基因组3′和5′端cDNA片段,并克隆至pGM-T载体中,然后分别测定插入片段的核苷酸序列,用DNAStar软件将测得的3′和5′端前导区序列与GenBank中选取的6株仙台病毒代表株相应序列进行相似性比较及序列比对,用RNAdraw软件预测基因组3′和5′端前导区二级结构并进行比较分析。结果副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′末端非编码区长度分别为119和142个核苷酸,前导区核苷酸序列与6株仙台病毒基因组的相似性分别在89.1%～96.4%和93.0%～96.5%,二级结构与选取的已知仙台病毒株高度相似而且稳定。结论副粘病毒Tianjin株基因组3′和5′端前导区序列相对保守,可能与病毒复制、转录调控及致病性有关。

新疆部分地区人类免疫缺陷病毒／丙型肝炎病毒合并感染者的丙型肝炎病毒5′端非编码区基因变异分析

目的：了解新疆部分地区 HIV-1／HCV 合并感染者的 HCV 基因变化规律。方法采用ELISA 法检测212例 HIV-1感染者的抗-HCV，柱式核酸纯化试剂盒提取血浆中病毒 RNA，以PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis 试剂盒进行反转录，并扩增 HCV 5′端非编码区（5′UTR）基因，将所获序列与 HCV 国际标准株进行比较，确定 HCV 基因型。计算4次采样毒株序列变异的基因离散率并建立进化树。结果212例 HIV-1感染者中抗-HCV 阳性157例，155例为静脉药瘾者，2例为异性性接触者。131例成功扩增 HCV 5′UTR 基因并进行了基因分型，结果3a 基因型占30．53％（40／131）、3b 基因型占17．56％（23／131）、1a 基因型占8．40％（11／131）、1b 基因型占42．75％（56／131）、6a 基因型占0．76％（1／131）。完成2年随访的38例感染者整体基因同源性为87．5％～99．3％，不同亚型的同源性有差异，同一样本的4次序列的同源性为99．3％～100．0％，变异率为0～0．7％。随着采样时间的推移，组内基因离散率以及与首次采样序列的组间基因离散率呈现依次增大的趋势。新疆地区HIV-1感染者体内的 HCV 的5′UTR 基因平均进化速率为1．62×10^－3替换／（位点·年）（95％CI ：1．52×10^－3～5．38×10^－3）。同一研究对象的4次序列之间相似度和同源度最高。结论新疆地区 HIV／HCV 合并感染率较高，静脉药瘾者高于异性性接触者。HCV 以1b 亚型为优势流行毒株。

中国小尾寒羊FSHR基因部分序列的克隆与分析

利用 PCR技术扩增了中国小尾寒羊 FSHR基因 5′端调控区和部分结构区序列 ,并通过克隆进行了序列测定。比较研究结果 :中国小尾寒羊与澳洲绵羊的 FSHR基因在 5′端有4个位点发生了单碱基插入 /缺失 (或缺失 /插入 )突变 ,序列间的保守性为 97.99% ;碱基变异率相应为 2 .0 1%。而二者在结构基因扩增区域的碱基变异率仅 0 .36 %。有

人类珠蛋白相关基因上游开放阅读框的变异分析

β-地中海贫血症是一种珠蛋白生成障碍的常染色体隐性遗传病。而γ珠蛋白基因的开放表达和胎儿血红蛋白的合成,是缓解β地中海贫血病人临床表型的一个重要因素。本研究针对202个血红蛋白相关调控基因或mi RNA,对1802个β-地中海贫血症患者进行了目标区域捕获测序。通过生物信息学的分析,检测出了所有捕获区域内的突变。进一步对位于5′端非编码区(5′untranslated region,5′UTR)的突变进行系统扫描,共计寻找到41个影响u ORF(upstream open reading frame,u ORF)有或无的功能性突变。从中选取了CHTOP基因(chr1:153606541 C>T)和TGFB1基因(chr19:41859418 G>A)的两个突变,通过定点诱变和双荧光素酶报告实验,在体外证实这两个突变均可显著地改变下游基因的表达。该研究结果为β-地中海贫血症临床表型的精确诊断提供了潜在的筛查靶点。