基于支持向量机的人类5'非翻译区剪接位点识别

基因非编码区域剪接位点的识别是基因识别中一个非常具有挑战性的问题,尤其是5'非翻译区中剪接位点的识别。与一般剪接位点不同,5'非翻译区剪接位点的两侧不存在由编码到非编码的状态转移,所以通常的剪接位点识别算法在非翻译区的性能不太理想。文章采用了基于支持向量机的方法对5'非翻译区中的剪接位点进行识别。为了提高识别精度,采用了基于矩阵相似性度量的核函数参数选取方法,它能够简单快速地确定合适的核函数参数,进而提高核函数的识别性能。通过实验验证,经过参数选择后的支持向量机能够较好地识别5'非翻译区剪接位点。

小麦抗逆相关基因TaSAP1的5′非翻译区内含子功能分析

逆境相关蛋白(stress associated protein,SAP)是植物中一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,而A20/AN1锌指蛋白主要参与植物逆境响应。小麦中TaSAP1基因参与植株对各种逆境的响应,其5′非翻译区含有2个内含子(5'untranslated region intron,5UI)。本研究利用重叠PCR,构建了TaSAP1的2个5UI缺失突变的表达载体,并转化二穗短柄草(Brachypodium distachyon),通过分析GUS活性,研究TaSAP1启动子及其5UI的生物学功能。结果表明TaSAP1启动子P1可受干旱、低温和外源ABA胁迫上调表达,表达活性分别是对照的10、6和4倍。TaSAP1基因2个5UI对启动子活性至关重要,2个5UI同时突变可致P1失活;Intron-1缺失突变导致P1活性降低约2.7倍(P<0.05),但不影响P1对逆境胁迫的响应;Intron-2缺失突变导致P1失去对干旱、低温和外源ABA的响应能力。本研究结果为深入研究TaSAP1 5UI的生物学功能奠定了基础,也为改善作物抗逆性提供了重要元件。

丙型肝炎病毒5’端非编码区的5’端序列对其翻译启动活性的影响

目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5’端非编码区(5’NCR)的5’端序列对其翻译启动活性的影响。方法用PCR技术扩增获得全长和5’端17个碱基缺失的HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5’端截短的HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP。用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功。表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P<0.01)。结论HCV5’NCR的5’端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCVIRES的结构提供了实验基础。

甲型肝炎病毒5'非翻译区对重组痘苗病毒表达甲肝抗原的影响

甲型肝炎病毒５＇非翻译区对重组痘苗病毒表达甲肝抗原的影响王晓洁，王全颖，伊瑶，郭可謇（中国预防医学科学院病毒学研究所，北京１０００５２）关键词：甲肝５＇非翻译区，甲肝重组痘苗病毒，甲肝抗原表达甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）属小核糖核酸病毒科（Ｐｉｃｏｍａｖｉ...

猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非翻译区一顶端茎环结构是病毒复制转录必需的顺式作用元件

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)基因组5'非翻译区(untranslated region,UTR)对病毒复制转录等生物合成过程至关重要,但其作用机制尚不清楚。本实验室分别在北美型(pAPRRS)与欧洲型PRRSV(pSHE)感染性克隆骨架的5'UTR与ORF1之间插入碱基"at"形成Nde I位点,构建了两个突变体pTLNd4和pSHEnde。结果显示插入后的碱基未影响病毒感染性。以两株突变体为骨架将两株感染性克隆的5'UTR互换,构建了突变体克隆pTLV8和pSHSP5。结果表明pTLV8仍具有感染性,而pSHSP5株拯救出病毒。对pSHSP5和pTLV8的RNA二级结构预测结果显示,虽然嵌合突变体pTLV8的5'端与亲本pAPRRS的二级结构差异较大,但转录调控序(transcription-regulating sequence,TRS)仍位于顶端茎环结构最突出的位置,并保证了TRS与ORF1之间的起始密码子AUG位于该茎环结构的顶端,而pSHSP5的顶端茎环结构则遭到了破坏。本研究结果表明TRS所在的顶端茎环结构在调控病毒复制转录过程中是关键的顺式作用元件之一,对其结构破坏的突变体将不能拯救出病毒。

丙型肝炎病毒5’-非翻译区的结构与功能研究

0引言 丙型肝炎病毒(HCV)是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒,属黄病毒科肝炎病毒类.在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染,并可导致慢性肝炎、肝硬化,或肝细胞癌[1,2].从不同患者中分离的病毒表现出明显的序列差异,从同一患者分离的病毒呈现出准种的特点.然而5'-非翻译区(5'-NTR,5'-nontranslated RNA)在HCV不同基因型却相对保守和稳定,这种序列保守的特点可能在病毒基因组的复制和翻译中起着重要的作用[3,4].

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTRcDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。结果提示结构域III是HCV5’UTRDNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTRDNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTRDNA序列的启动子活性;HCV5’UTRcDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。

PPP1R3基因3′非翻译区5bp缺失/插入多态性与安徽汉族人2型糖尿病相关性研究

目的 研究 1型蛋白磷酸酶骨骼肌特异糖原靶向调节亚单位 (PPP1R3)基因 3′ UTR 5bpD/I多态性与 2型糖尿病 (T2DM )及其中间表型的相关性。方法 选取安徽省合肥地区汉族T2DM患者 16 0例 ,健康成人 10 6例 ,运用聚合酶链反应片段长度多态性技术进行基因型测定。结果 ①PPP1R3基因 3′ UTR 5bpD/I多态性的基因型及等位基因频率在T2DM与健康对照组间分布差异没有显著性 (P >0 0 5 ) ;②不同基因型组间空腹血糖、血压、空腹胰岛素、胰岛素敏感指数、体重指数、腰臀围比差异均无显著性 ,糖尿病组中基因型D/D的餐后 2h血糖显著低于基因型D/I、I/I(P=0 0 32 )。结论 PPP1R3基因 3′ UTR 5bpD/I多态性与安徽汉人

猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM株5′和3′非翻译区克隆与测序

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM株5′非翻译区(5′UTR)和3′非翻译区(3′UTR)的准确序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术进行克隆测序。结果表明,5′和3′末端快速扩增技术(5′RACE和3′RACE)能很好地扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的末端序列,分别获得长度为493bp和750bp的片段。与NCBI中已发表的原野毒株TJ株序列(EU860248.1)及其他毒株比对分析发现,TJM株5′UTR较TJ株有4处突变,突变后与XJu-1株序列完全一致,其中,前3处突变与许多亚洲毒株相同,3′UTR序列没有改变。通过预测RNA二级结构发现,TJM株5′UTR核苷酸序列的改变能够影响RNA二级结构,而该二级结构是病毒复制和拯救的关键。TJM株5′和3′末端序列的获得,为病毒基因组功能结构分析和全长感染性克隆的构建奠定了基础。

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。

口蹄疫病毒5’端非翻译区致病机理的分子基础

该文阐述了口蹄疫病毒5’端非翻译区的结构和功能,综述了近年来口蹄疫病毒5’端非翻译区与宿主细胞间关系及其致病机制方面的研究进展,分析了口蹄疫病毒5’端非翻译区致病机理的分子基础,认为其5’端非翻译区的基因组结构对口蹄疫病毒的复制和扩增是必不可少的,为进一步研究口蹄疫病毒的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机理、致病机理及宿主嗜性提供理论参考。

丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅰ、Ⅱ在其翻译启动活性中的作用具有细胞特异性

目的分析在不同宿主细胞的翻译体系下,缺失不同片段的HCV 5'UTR翻译启动活性的差异。方法以脂质体介导基因转染技术,将截短型HCV 5'UTR调控Fluc的真核表达质粒与Rluc真核表达质粒p RL-TK共转染至不同的细胞中,转染后36 h:6提取细胞RNA,半定量RT-PCR检测目的质粒的转录水平;6用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc基因相对表达活性,分析HCV 5'UTR缺失不同结构域后在不同翻译体系中翻译启动活性的差异。结果 6缺失5'端44个碱基的HCV 5'UTR的翻译启动活性分别与缺失前相比:在He La细胞和C6细胞中无明显影响,在L-02细胞中活性下降为46%,而在293T细胞则为缺失前的146%;6缺失5'端118个碱基后,HCV 5'UTR的活性分别与缺失前相比:在He La细胞中,缺失后活性仅为缺失前的49%,而在L-02细胞、C6细胞和293T细胞中,活性分别为缺失前的140%、160%和235%。在本研究使用的四种细胞中,p CNl的翻译启动活性的差异无统计学意义,p CNl-d2在293T细胞中活性最高,在L-02细胞中活性最低。p CNl-d3在293T、C6和L-2细胞中活性相近,但在He La细胞中的活性明显比其他细胞低。结论 HCV 5'UTR的DomainⅠ和DomainⅡ对其翻译启动活性的影响与宿主细胞种类相关,具细胞特异性。

利用多样性增量位置得分函数预测人类5'非翻译区剪接位点

5’非翻译区中的剪接位点两侧不存在由编码区到非编码区的状态转换,所以通常的识别剪接位点的算法在非翻译区的性能不太理想.本文把多样性增量的位置得分函数应用到5’非翻译区剪接位点的识别中.对于供体端,正负集样本数之比为1∶17,识别敏感性为66.91%,阳性预报值为68.54%,总精度为96.45%,ROC曲线下面积为97.23%;对于受体端,正负集样本数之比为1:24,识别敏感性为77.19%,阳性预报值为29.37%,总精度为91.78%,ROC曲线下面积为93.91%.这一结果要好于已有相似算法.

雌激素受体2(ESR2) mRNA 5'非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析

真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的翻译机制。雌激素受体2(estrogen receptor 2,ESR2)是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA5'非翻译区(5'untranslated region,5'UTR)具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5'UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5'UTR插入到双顺反子报告基因载体(pRF)中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5'UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5'UTR中的内部潜在启动子(P<0.0001)、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3'端的439~468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5'UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。

转录因子FOSB mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

研究FOSB基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosme entry site,IRES),进而探究其生理功能。作者利用双顺反子报告载体(pRL-FL),构建检测质粒(pRL-FOSB-FL),并将其转染到人胚肾细胞HEK293和4种癌细胞中,检测FOSB mRNA 5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)IRES活性并通过逐步截断探索其活性中心,最后对肝癌细胞Bel-7402进行药物(紫杉醇和顺铂)刺激。报告载体的结果显示,FOSB mRNA 5′UTR具有IRES活性,且在不同细胞中FOSB IRES活性存在显著性差异,在卵巢癌细胞A2780/WT细胞中FOSB IRES活性较高。序列截断发现,FOSB mRNA 5′UTR中的160nt(-376到-217)对其IRES的功能至关重要.在肝癌细胞中,随着加药浓度的增加,其IRES活性逐渐增加,尤其在紫杉醇刺激下活性增加更为明显。本研究发现的FOSB基因的这些特性为研究FOSB在肿瘤的预防与治疗提供了一种新的思路。

胸苷酸合成酶基因5′-端非翻译区域多态性在肺癌诊疗中的应用

目的探讨胸苷酸合成酶(TS)基因5′-端非翻译区域(5′-UTR)多态性在肺癌诊疗中的应用效果。方法回顾性分析2018年8月至2019年6月50例非小细胞肺癌患者临床资料,所有患者均实施顺铂化学治疗方案,化学治疗2~3个周期后对其临床化学治疗总有效率进行评价,根据其化学治疗效果的不同分为A组(化学治疗敏感性高,25例),B组(化学治疗敏感性低,25例),2组均使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TS基因5′-UTR多态性进行检测,比较化学治疗敏感性与TS基因5′-UTR多态性与化学治疗敏感性及化学治疗毒性反应的关系。结果A组中TS基因5′-UTR2R/3R+2R/2R的分布率80%(20/25)明显高于B组48%(12/25),差异有统计学意义(P<0.05);非小细胞肺癌患者中TS基因5′-UTR2R/3R+2R/2R对化学治疗的毒性反应明显高于携带TS基因5′-UTR3R/3R,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TS基因5′-UTR2R/3R+2R/2R在化学治疗效果较好的患者中有着较为广泛的分布,并且TS基因5′-UTR3R/3R者对铂类化学治疗具有较强的耐药性。

BamHI酶切位点变异区域性分布在HCV1b型5'非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布。方法对来自中国4个不同地区的64例HCV1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用MboⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异。结果测序证实中国HCV1b基因型在117位有BamHⅠ酶切位点。64例血清样品中,BamHⅠ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;MboⅠ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例。结论证实HCV1b型BamHⅠ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少。而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究。

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5′-非转录区(5′-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响。方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5′-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化。结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍。结论:pPIC9 5′-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达。