尿5′-核苷酸磷酸二酯酶的测定方法

目的 :建立一种测定尿 5 ` -核苷酸磷酸二酯酶 (5′- NPD)的新方法 ,试图为临床诊断提供一项检测早期肾损害的生化指标。方法 :以 5′- [5 -碘吲哚酚 - (3) ]胸腺嘧啶核苷酸铵盐作为检测尿 5′-核苷酸磷酸二酯酶的底物 ,在 p H9.0缓冲体系中进行酶促反应后 ,在波长 A5 80 nm下测定尿 5′- NPD的吸光度 (OD)值。结果 :该法重复性 :cv =1.98% ;尿5′- NPD酶活力与 OD值的线性关系 :Y=4.116 X+0 .0 2 76 ,r =0 .993.用该法分别检测 30例肾病患者和 5 0例正常人的尿 5′- NPD,肾病患者的尿 5′- NPD酶活力明显高于正常人 (P <0 .0 1)。结论 :提示尿 5′-

血清5′-核苷酸磷酸二酯酶Ⅰ对原发性肝癌的诊断价值

对310例原发性肝癌(PHC)、44例继发性肝癌、253例肝外恶性肿瘤、121例良性疾病患者和68例正常人血清进行5′一核苷酸磷酸二酯酶(5′-NPD_(ase))同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳以及激光凝胶扫描半定量测定。结果表明①5′-NPD_(ase)I阳性率在PHC组为79.68％,在AFP阴性(≤20μg/L)PHC组为68.75％;②AFP与5′-NPD_(ase)I联合测定可提高PHC检出率;③以慢性乙型肝炎和肝硬化患者5′-NPD_(ase)I面积积分均值作为阳性界值,PHC阳性率为69.35％。

5′-核苷酸磷酸二酯酶同工酶鉴别良恶性腹水的诊断价值

对37例恶性腹水和35例良性腹水测定5′-NPD同工酶,结果表明:恶性腹水中5′-NPI)-Ⅴ和Ⅵ的阳性率明显高于良性腹水(P<0.01)。特异性分别为80%和74.3%;腹水5′-NPD-Ⅴ与血清相关性γ=0.7804(P>0.05)。提示:腹水5′-NPD同工酶检测有助于良恶性腹水鉴别诊断。在疑恶性腹水时有必要进行腹水5′-NPD同工酶检测。

过表达果糖脱氢酶促进氧化葡萄糖酸杆菌高效合成5-酮果糖

5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢酶基因在Gluconobacter oxydans中过表达,通过对不同的宿主、表达载体和启动子的筛选,获得一株能够高效合成5-KF的工程菌QT-10。在3 L发酵罐中进行补料发酵优化,最终采用恒速连续流加果糖的方式,该工程菌可在82 h内消耗质量浓度为650 g/L的D-果糖,5-KF的产量高达608 g/L,产率为94.6%,时空产率为7.41 g/(L·h)。

两种3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的制备及活性测定

3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶[EC.1.4.17](简称PDE),在生物体内有重要的生化功能.它可水解环核苷酸为5'-核苷酸,并与核苷酸环化酶共同维持细胞内环核苷酸水平.根据性质的不同PDE分为多种形式,但总的可分为两大类:依赖于Ca2+的PDE,可被钙调蛋白激活;不依赖于Ca2+的PDE,不被钙调蛋白激活.开展对环核苷酸、钙调蛋白及药物杀虫机理的研究都需要分离制备这两类不同形式的PDE.本实验以新鲜的猪心为材料制备分离出这两种PDE,并进行了活性分析.

顺铂致大鼠肾损害与尿5'-核苷酸磷酸二酯酶的关系

目的 :探讨尿 5 '-核苷酸磷酸二酯酶 (5 '- NPD)能否反映顺铂导致的早期肾损害。方法 :采用完全随机设计方法 ,建立顺铂致大鼠肾损害动物模型 ,通过检测顺铂致大鼠肾损害过程中尿 5 '- NPD的活性变化 ,同时用光镜和电镜观察大鼠肾脏的病理改变 ,以验证尿 5 '- NPD能否反映早期肾损害。结果 :实验中空白对照组 (IV组 )和小剂量顺铂组 ( 组 )大鼠的尿5 '- NPD活性以及肾脏病理组织学均无明显改变 ;大剂量顺铂组大鼠 ( 组和 组 )在投药后第 2天 ,尿 5 '- NPD活性开始升高 ,第 4天到达高峰 ,活性明显高于 组和 组 ,而肾脏的病理改变则出现得相对迟缓 ,投药后第 8天可见肾小管中度扩张 ,部分区域有炎性细胞浸润 ;第 15天有较多肾实质细胞坏死。结论 :尿 5 '- NPD指标对顺铂导致的肾损害反映较灵敏 。

大白鼠甲状腺细胞膜系统3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性的电镜细胞化学定位

本研究用酶电镜细胞化学法观察了大白鼠甲状腺细胞3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性的定位。结果证明,3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的活性定位于甲状腺滤泡细胞的顶部细胞膜和微绒毛,在内质网则存在于膜的外表面,在甲状腺滤泡细胞核也位于核膜的外表面。在甲状腺滤泡上皮细胞之间的微血管内皮细胞膜上也观察到了大量3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的阳性反应颗粒。

高效液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱法快速筛查保健食品中非法添加的磷酸二酯酶-5抑制剂及其类似物

采用离子阱飞行时间串联质谱（LC-MS-IT-TOF）技术对保健食品中非法添加的西地那非、他达那非和红地那非等28种磷酸二酯酶-5抑制剂（PDE-5）及其类似物进行快速筛查和确证.建立了此28种化合物的精确分子质量数和多级质谱碎片离子数据库.样品经甲醇超声提取,以C18色谱柱（150 mm ＆#215;4.6 mm,3.5 μm）分离,乙腈-0.1％乙酸为流动相梯度洗脱.结果显示,28种化合物的筛查检出限为0.2～7.0μg/L,定量下限为0.04～1.18 mg/kg（胶囊样品）和0.007～0.235 mg/L（口服液）.以定量下限浓度为加标水平的平均回收率为31.0％～114.0％,相对标准偏差（RSD）为2.5％～14.9％.利用精确质量数匹配和自建标准谱库检索,实现快速筛查;结合保留时间、同位素丰度和多级特征碎片离子对目标化合物进行确证.该方法具有简便、快速、准确、灵敏度高等优点,适用于保健食品中非法添加的磷酸二酯酶-5抑制剂（PDE-5）及其类似物的高通量筛查和定性鉴定.根据裂解规律的归纳总结,还可应用于其未知衍生物及结构类似物的分子式预测和结构推导.

麦芽根中5′-磷酸二酯酶的制备及性质

从麦芽根中提取 5′-磷酸二酯酶 ,酶活可达 474U/ m L。将所得酶液用于水解酵母核糖核酸 ,得到 5′-CMP、UMP、GMP、AMP 4种单核苷酸。最佳反应条件为 :底物 RNA浓度为0 .0 1 g/ m L,每毫升底物的酶用量为 3 0 U,酶解温度 70°C,p H7.0 ,时间 2 h,5′-核苷酸转化率达80 %。

高活力5′-磷酸二酯酶制备及水解RNA的研究

目的:获得高活力5′-磷酸二酯酶液,提高核酸RNA酶解效率。方法:采用超滤和盐析技术对从麦芽根浸提液中纯化5′-磷酸二酯酶工艺进行研究,采用单因子试验法优化酶解工艺条件。结果:浸提液依次经过5万Da超滤膜浓缩、40%饱和度硫酸铵盐析、5万Da超滤膜脱盐后,酶活力可达1 500U/ml;第1次超滤膜透过液可作为浸提液循环使用,酶活力是水浸提的1.15倍;第2次超滤膜透过液浓缩5倍后,可回收56.46%硫酸铵,浓缩母液可按1∶2比例循环使用;在底物浓度5.8%、酶用量8%、反应时间2h条件下,RNA酶解率可达95%。结论:初步建立了适合工业化规模的核苷酸生产新工艺。

Calcineurin/NFAT信号通路上调5型磷酸二酯酶的表达及介导内皮素-1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探讨Calcineurin/NFAT信号通路是否介导内皮素-1(ET-1)诱导的5型磷酸二酯酶(PDE5)的表达及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖;同时验证Calcineurin抑制剂环孢素A及PDE5抑制剂西地那非能否抑制ET-1刺激的PASMCs增殖。方法以ET-1刺激PASMCs增殖,分别于ET-1刺激前给予环孢素A或西地那非抑制Calcineurin或PDE5的活性。采用Calcineurin活性检测试剂盒检测其活性,免疫印迹法检测PDE5的表达,酶联免疫吸附法检测cGMP的含量,3H-TdR渗入法检测PASMCs的增殖。结果 ET-1可激活原代培养的PASMCs中Calcineurin的活性,上调PDE5表达,降低cGMP的水平。Calcineurin特异性抑制剂环孢素A可阻断ET-1的上述作用;抑制PDE5的活性可逆转ET-1导致的cGMP含量减少。而环孢素A及西地那非可分别抑制ET-1刺激的PASMCs增殖。结论 ET-1可通过激活Calcineurin/NFAT信号通路介导ET-1诱发的PDE5表达,进而降低cGMP含量,引起PASMCs增殖;而抑制Calcineurin或PDE5可提高cGMP水平,抑制ET-1诱导的PASMCs增殖。

5′-磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优化

以ATCC14994为出发菌株 ,采用紫外线与亚硝基胍相结合的多次诱变育种 ,获得 1株 5′ 磷酸二酯酶高产菌株HAT2 2 2 8。通过单因子和正交试验对该菌株的产酶发酵条件进行了优化 ,优化发酵产酶条件为 :蔗糖 5 %,酵母膏 0 .3%,蛋白胨 0 .3%,K2 HPO4 0 .8%,KH2 PO4 0 .8%,MgSO4 0 .2 %,ZnSO4 0 .2 %,培养基起始 pH6 .0 ,接种量10 %,培养温度 30℃ ,摇床转速 12 0r/min ,发酵时间 48h。在优化条件下 ,HAT2 2 2 8的产酶水平达 132

5'-磷酸二酯酶强化香菇风味基料中鲜味成分

研究了5'-磷酸二酯酶强化香菇鲜味成分的工艺条件及其作用.在香菇打浆料中添加5'-磷酸二酯酶及酵母粉,研究各因素对5'-核苷酸产量的影响.结果表明,酵母粉用量、5'-磷酸二酯酶用量、酶解体系pH值、酶解温度及时间等因素对鲜味核苷酸生成有重要影响,正交试验优化的酶解工艺条件为:酵母粉用量5%,5'-磷酸二酯酶用量5%,pH值4.0,酶解温度60℃,酶解时间60min.在此条件下制备的香菇风味基料中鲜味核苷酸(5'-IMP、5'-GMP)产量达到30.01 mg/g,较未经5'-磷酸二酯酶处理基料的鲜味核苷酸产量提高了3倍.

5-磷酸二酯酶抑制剂对噪声性聋影响的实验研究

目的探讨5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂对豚鼠噪声性聋的影响。方法豚鼠随机数字表法分为对照组、噪声暴露组和西地那非给药组,每组15只。西地那非组及噪声组豚鼠在白噪声暴露1周后分别腹腔注射西地那非10mg/(kg.d)及生理盐水4 ml/(kg.d),连续给药4周。分别测试噪声暴露前1天、噪声暴露后1、2及4周听性脑干反应(ABR)阈值及80dB HL下ABRⅠ波潜伏期,并通过扫描电镜观察噪声暴露后4周豚鼠耳蜗毛细胞的形态变化。结果与噪声暴露前相比,西地那非组ABR阈值及Ⅰ波潜伏期均小于噪声组,差异具有统计学意义(P值均<0.01)。扫描电镜显示,噪声组豚鼠耳蜗内、外毛细胞均出现听毛紊乱、融合及缺失;而西地那非组耳蜗病变较轻,听毛仅有轻微倒伏、融合现象。结论西地那非能够减轻噪声对豚鼠耳蜗毛细胞的损害,降低噪声性听觉损伤引起的ABR阈值升高,缩短其引起的Ⅰ波潜伏期延长。

超高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂

建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定保健食品中10种磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂。样品采用Waters Acquity UPLC BEH C18（100mm×2.1mm×1.7μm）色谱柱分离,以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,甲醇为提取溶剂超声萃取,经HLB固相萃取柱净化浓缩;在电喷雾正离子模式下,以多反应监测（MRM）模式进行检测。结果表明,10种磷酸二酯酶-5抑制剂在1.0-100.0μg/L范围内线性关系良好,线性相关系数（R2）均大于0.993,方法定量限为1.0μg/kg;空白样品在100.0、200.0和1 000.0μg/kg添加水平下的回收率为85.6%-94.3%。该方法简便、快速、检出限低,适用于保健食品中10种磷酸二酯酶-5抑制剂的同时检测。

麦芽根提取5′-磷酸二酯酶对RNA酶解工艺研究

从麦芽根提取中的5′-磷酸二酯酶,原酶液酶活达到300U/mL。将提取的酶液用于水解酵母RNA,得到5′-AMP、UMP、CMP、GMP四种核苷酸,并系统研究了麦芽根5′-磷酸二酯酶对核酸的酶解条件。结果表明,最佳反应条件为:底物浓度3%,酶用量5%,温度68℃,pH6.5,水解时间为4～5h,在此条件下,酶解率可以达到84%。在酶解2h内补加RNA底物可提高酶利用率。

5′-磷酸二酯酶的研究进展

5′-磷酸二酯酶是水解磷酸二酯键生5′-磷酸物质的酶,用于水解核酸得到5′-核苷酸,随着核苷酸产业的发展,该酶的研究和应用也愈发显得重要起来,重点论述了在5′-核苷酸生产中常用的5′-磷酸二酯酶的作用方式、酶的性质和酶的制备及应用。

5-磷酸二酯酶抑制剂他达拉非治疗对伴有感音神经性聋的性功能障碍患者听功能的影响

目的观察5-磷酸二酯酶(5-phosphodiesterase,PDE5)抑制剂他达拉非对伴有感音神经性聋性勃起功能障碍患者听功能疗效的影响。方法38例患者(60耳)给予PDE5抑制剂(选用他达拉非Tadalafil Eli Lilly Nederland B.V生产,国药准字H20170286)10 mg口服,性生活前1 h服用,以连续治疗2周为1个疗程。在治疗前和治疗2周后用纯音测听测试患者的听力。结果PDE5抑制剂在治疗伴有感音神经性聋的勃起功能障碍患者前后60耳感音神经性聋患者中治疗总有效率高达83.33%,轻度聋患者治疗有效率为100%,中度聋患者92.3%治疗有效,重度聋患者治疗有效率为80%,极重度聋患者有50%治疗有效。38例感应神经性聋患者服用PDE5抑制剂前后纯音测听频率均值比较治疗前(64.5±5.2)dB HL,治疗后(42.3±3.4)dB HL,差异有统计学意义(P<0.01)。结论PDE5抑制剂在改善勃起功能障碍伴感音神经性聋患者勃起功能的同时,对感音神经性聋也有一定的治疗效果,尤其在改善轻度、中度感音神经性聋患者听功能、耳鸣症状方面具有显著的效果,PDE5抑制剂可能成为治疗或保护感音神经性聋的一种潜在的药物。

5′-磷酸二酯酶的提取

主要研究了桔青霉与麦芽根提取 5′ -磷酸二酯酶的方法 ,并对二者进行了比较。用快速登高法确定了麦芽根提取 5′ -磷酸二酯酶的最优区域。在此区域内浸提的 5′ -磷酸二酯酶酶活力可达 30 0U/ml。酶液经超滤浓缩、冷冻干燥可制备得率较高的粗酶粉。

5-磷酸二酯酶抑制剂对庆大霉素所致豚鼠耳毒性影响的研究

目的探讨5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂对庆大霉素所致豚鼠耳毒性的听功能及耳蜗形态学的影响。方法采用随机数字表法将36只豚鼠分为空白对照组、庆大霉素组和PDE5抑制剂组,每组各12只;其中空白对照组未给予特殊处理,庆大霉素组和PDE5抑制剂组给予连续腹腔注射庆大霉素120 mg·kg^(-1)·d^(-1)3周后,庆大霉素组继续给予腹腔注射生理盐水4 ml·kg^(-1)·d^(-1),PDE5抑制剂组给予腹腔注射他达那非(选择性5-磷酸二酯酶抑制剂)2 mg·kg^(-1)·d^(-1),均连续给药4周后,分别测试庆大霉素给药前1天、庆大霉素给药后3周、给药生理盐水和他达那非后1、2及4周三组豚鼠听性脑干反应(ABR)阈值及波Ⅰ潜伏期,扫描电镜观察生理盐水和他达那非给药4周后豚鼠耳蜗毛细胞的形态变化。结果在庆大霉素给药3周后,PDE5抑制剂组与庆大霉素组ABR阈值及波Ⅰ潜伏期较空白对照组明显升高及延长(均为P<0.01),PDE5抑制剂组与庆大霉素组之间差异无统计学意义(P>0.05)。在给予他达那非干预1、2、4周时,PDE5抑制剂组ABR阈移及波Ⅰ潜伏期均小于庆大霉素组,差异有统计学意义(均P<0.01)。用药4周后扫描电镜观察,庆大霉素组豚鼠耳蜗外毛细胞听毛紊乱、融合及缺失;而PDE5抑制剂组耳蜗病变较轻,听毛仅有轻微倒伏、融合现象。结论PDE5抑制剂能够减轻庆大霉素所致豚鼠耳蜗毛细胞损害,对庆大霉素引起的听力损伤有一定的治疗作用。