牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了BVDV的RT-PCR检测方法。该方法从BVDV标准毒株NADL中扩增出了279bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1×TCID50。提取9份细胞毒总RNA后,进行一步法RT-PCR扩增可获得一致的检测结果,说明该方法重复性很好。应用该方法对45份临床疑似患牛的样品进行检测,结果检出4份阳性,表明该方法具有较好的临床应用性,且检测结果与参考实验室检测结果完全相符,可用于BVDV的快速诊断。

河南省牛肠道病毒的分离、鉴定及流行病学调查

为了解河南省不同地区的牛群是否存在牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)感染及其感染情况,以便为BEV感染的防控提供流行病学资料,试验应用吉林大学动物检验检疫教研室建立的检测BEV抗原的双抗体夹心ELISA方法对采自河南省不同地区牛场的363份粪便样品进行检测,并对部分检测为阳性的病料进行病毒的分离培养、电镜观察及免疫学鉴定。将分离得到的阳性病毒毒株接种MDBK细胞后进行BEV 5′UTR基因的RT-PCR扩增及序列测定。结果表明:牛群的BEV感染率高达21.49%,不同地区牛群均存在程度不同的BEV感染率(2.50%～46.67%)。对ELISA检测为阳性的部分粪便样品进行病毒的分离培养、电镜观察及免疫学鉴定,获得了两株BEV毒株(BEV-HeN-YR2、BEV-HeN-YR91)。分离毒株的5′UTR基因序列的RT-PCR扩增产物测序后比对分析,两株BEV毒株均为F种肠道病毒。说明河南省不同地区牛群存在不同程度的BEV感染,且感染的BEV主要为F种。

致细胞病变型新疆BVDV基因2型毒株的分离鉴定及其致病性

为了解新疆博乐地区某牛场牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及致病性,采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测粪便样品,将阳性病料接种至胎牛肾细胞(madin-darby bovine kidney,MDBK),盲传15代后通过5轮蚀斑纯化试验得到1株致细胞病变型(cytopathic type,CP)BVDV毒株;通过理化性质检测、间接免疫荧光试验、电镜观察、基因序列分析及小鼠致病性试验对该毒株进行鉴定。结果显示:成功分离纯化得到1株CP BVDV毒株,将其命名为BVDV-BL314株;盲传15代BVDV毒株接种至MDBK细胞培养引起明显的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落、产生合胞体等致细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE);测定该毒株的滴度为2×10^(8) TCID50/0.1mL;理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂敏感,对酸碱敏感;56℃处理30min可显著性降低病毒活性;间接免疫荧光试验检测胞浆中可见特异性荧光;电镜观察该病毒呈球形,直径为40~60nm;遗传进化分析显示该分离株与BVDV-125c株有较近的亲缘关系,属于BVDV-2a基因亚型;免疫BALB/c小鼠后,剖检表现为多器官肿大、出血、质地变脆,边缘钝圆,无光泽等症状;镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化。结果表明,分离纯化得到1株致细胞病变型新疆地方性BVDV基因2型毒株,且具有较强的致病性,将为新疆BVDV流行病学调查及致病机制研究提供依据。