TNF-α增强主动脉平滑肌细胞内1型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达参与感染性休克的发生机制

目的研究TNF-α对主动脉平滑肌细胞(VSMC)内1型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3RⅠ)表达的影响,揭示TNF-α影响VSMC收缩功能参与感染性休克的发生机制。方法原代分离培养大鼠VSMC。按TNF-α处理的不同时间点(0、4、8、24h)分4组。分别应用Western blot、免疫荧光、RT-PCR、双荧光素酶检测方法,观察TNF-α对IP3RⅠmRNA、蛋白表达及其启动子活性的影响。结果 TNF-α处理组细胞内IP3RⅠ分布未见变化,8、24h组荧光强度增强提示IP3RⅠ蛋白含量增加,IP3RⅠ蛋白表达升高(4h:1.059±0.005 vs 1.000±0.002,P=0.010;8h:2.416±0.042 vs 1.000±0.002,P<0.01;24h:2.138±0.010vs 1.000±0.002,P<0.01,n=9),IP3RⅠmRNA表达明显增加(4h:2.260±0.889 vs 1.00±0.02,P=0.193;8h:5.449±2.279 vs1.00±0.02,P=0.000;24h:3.049±1.684 vs 1.00±0.02,P=0.042,n=9)。转染PGL3-IP3RⅠpromoter质粒后TNF-α组IP3RⅠ启动子活性明显增强(3.56±0.65 vs 1.00±0.05,P=0.020,n=9)。结论 TNF-α可上调IP3RⅠ基因启动子活性,从而引起IP3RⅠ蛋白表达升高,增强VSMC内IP3Rs系统介导的Ca2+释放作用,这可能是TNF-α影响VSMC收缩功能参与感染性休克血管调控的机制之一。

PKC在人肾小球系膜细胞IP3R1表达中的作用

目的探讨肿瘤坏死因子（TNF-α）对人肾小球系膜细胞（HMCs）IP，R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC在此信号通路中的作用，以期为肝肾综合征（HRS）肾小球滤过率下降的发生机制提供理论依据。方法用实时定量PCR和免疫印迹检测IP3R1mRNA和蛋白表达的情况，并分别用蛋白激酶c（PKC）激动剂PMA、PKCct、PKCB特异性抑制剂及HA—DN—PKCct质粒转染干预上述诱导实验检测IBRl的表达变化。此外，免疫印迹检测TNF-α对P-PKCct蛋白的表达影响。结果TNF-α明显上调IRRl蛋白和mRNA表达。PMA、PKCcx抑制剂Safingol和HA-DN-PKCoL质粒瞬时转染预处理HMCs后，均能明显阻断TNF-α诱导IP3R1蛋白的表达，而PKCB抑制剂Rottlerin预处理后，对IRR1蛋白表达无明显影响。此外，TNF-α刺激HMCs，各不同时间组总PKCct蛋白表达无明显差异，而TNF-α刺激8hp-PKCα蛋白表达明显增加。结论TNF-α能上调人系膜细胞IP3R1蛋白及mRNA的表达，TNF-α活化PKCct是TNF-OL上调帔R1表达的重要上游信号。

TNF—α通过PKCα信号通路诱导人系膜细胞IP3R1表达

目的探讨肿瘤坏死因子（TNF—α）对人。肾小球系膜细胞（HMCs）I型1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP，R1）蛋白和mRNA表达的影响及其分子机制，以期为肝肾综合征（HRS）肾小球滤过率下降的发生机制和防治思路提供理论依据。方法用实时定量PCR和免疫印迹法检测TNF-α刺激HMCs0、2、4、8、24h的IP3R1mRNA和蛋白表达的情况。以TNF-α刺激HMCs8h为对照，应用D609，U73122，PP1，Safingol和Rottlerin预处理HMCs后，实时定量PCR法检测JJTNF-α对IP3R1mRNA表达的影响；以TNF-α刺激HMCs24h组为对照，免疫印迹法检测上述抑制剂预处理后，TNF-α对IP3R1蛋白表达的影响。此外，应用非放射性测活法检测0、4、8、24hTNF-α对PKC-α的活化影响，并予D609、Safingo干预后，检测TNF-α对PKC-α的活化的影响。结果TNF-α刺激HMCs2h到8hIP3R1mRNA表达明显增加，于8h达高峰（P〈0．01），而于24h有所下降（P〈0．01）；而IP3R1蛋白表达于TNF-α刺激4h开始升高，至24hIP3R1蛋白升高达高峰（P〈0．01）。与8h组比较，抑制剂＋TNF-α各组中，Safingol＋TNF-α组和D609＋TNF-α组IP3R1mRNA的表达明显下降，差异具有统计学意义（3．30±0．81）vs．（1．95±0．13），P〈0．05；（2．10±0．49），P〈0．01。与24h相比，Safingol＋TNF-α组和D609＋TNF-α组，IP3R1蛋白的表达亦明显下降（3．09±0．13）vs．（1．86＋0．39），P〈0．01；（1．98±0．02），P〈0．01。非放射性测活检测显示TNF-α处理8h使PKC—α自动磷酸化而活化，而D609或Safingol预处理后，可抑制TNF-α对PKC-α的活化。结论TNF-α能上调IP3R1mRNA及蛋白的表达，PC-PLC／PKC—α信号途径可能在TNF-α上调1只R1的表达中起重要作用。