微RNA-30d-5p通过调控ABCB5对胰腺癌进程的影响

目的 探讨微RNA(miR)-30d-5p在胰腺癌(PAAD)中的潜在作用和调控机制。方法 选择2016年12月至2019年1月来新疆维吾尔自治区人民医院接受手术治疗的胰腺癌病人35例,术后即刻获得胰腺肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织,采用实时定量PCR检测miR-30d-5p在胰腺癌组织和细胞中的表达水平。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)、克隆形成、transwell和流式细胞术检测miR-30d-5p对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。通过萤光素酶测定和蛋白质印迹法评估miR-30d-5p对ABCB5表达的调控作用。进一步构建裸鼠成瘤模型通过肿瘤质量和体积验证miR-30d-5p对肿瘤生长的影响。采用苏木精伊红染色验证肿瘤组织增殖情况。结果 与癌旁组织(1.03±0.17)及正常细胞(0.98±0.18)相比,胰腺癌组织(0.35±0.08)和细胞(0.63±0.08,0.23±0.07,0.48±0.07及0.31±0.05)中miR-30d-5p的表达显著降低(P<0.05);miR-30d-5p的过表达抑制了肿瘤细胞的活力、迁移和侵袭并促进了细胞凋亡且差异有统计学意义(P<0.05);抑制ABCB5的表达能抑制细胞活力、迁移和侵袭性并促进了胰腺癌的细胞凋亡且差异有统计学意义(P<0.05);体内实验证明miR-30d-5p组能够抑制肿瘤生长且差异有统计学意义(P<0.05)。结论MiR-30d-5p通过靶向ABCB5影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡,可能是PC病人潜在的预后生物标志物及靶向治疗的靶点依据。

谷氨酰胺转运载体SLC1A5对食管鳞癌细胞恶性生物学的影响及其机制

目的探讨谷氨酰胺转运载体SLC1A5在食管鳞癌细胞系中的表达、对增殖和侵袭的影响及其作用机制。方法采用实时定量PCR及免疫印迹法检测人正常食管上皮细胞系(SHEE)和食管鳞癌细胞系(KYSE30、KYSE70、KYSE140、TE1)中SLC1A5的表达水平。在SLC1A5高表达的KYSE70细胞中采用CRISPR/Cas9方法敲除SLC1A5,采用CCK8测定和划痕实验检测对照、敲除SLC1A5和使用SLC1A5抑制剂V-9302后KYSE70细胞的增殖和迁移能力。采用GSH/GSSG试剂盒检测对照、敲除SLC1A5和使用SLC1A5抑制剂V-9302后KYSE70细胞的谷氨酰胺代谢情况。结果SLC1A5在食管癌细胞系KYSE70中高表达,与正常食管上皮中的表达有统计学差异(P<0.05)。SLC1A5敲除或被抑制的KYSE70细胞的增殖能力低于未处理细胞(P<0.05),处理组划痕的迁移面积较未处理组明显减少(P<0.05),处理组的GSH/GSSG比率较未处理组的显著降低(P<0.05)。结论SLC1A5在ESCC细胞系中表达增高,抑制SLC1A5可降低ESCC细胞的增殖迁移能力与谷氨酰胺代谢,SLC1A5可能是食管癌治疗的潜在靶点。

小肽Ospep5对水稻耐镉性的影响

镉(Cd)胁迫是植物面临的主要重金属胁迫之一,对植物的生长和发育产生严重的影响。尽管已有研究表明植物小肽具有缓解胁迫的作用,但水稻中镉毒害的研究很少。在前期研究中,通过翻译组、转录组和蛋白质组鉴定了一系列水稻小肽,其中发现Ospep5可以显著地提高水稻的耐盐性。本研究以日本晴野生型、日本晴过表达Ospep5-OX和日本晴CRISPR/Cas9突变体ospep5-3作为水稻试验材料,研究Ospep5对镉胁迫下水稻幼苗生长的影响。试验结果表明:500μmol L^(–1)CdCl_(2)处理显著抑制了水稻幼苗的形态生长和叶绿素含量,同时超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和镉离子含量显著提高。与单独的镉胁迫相比,外源施加Ospep5后,可以有效缓解镉胁迫对水稻幼苗的形态生长的抑制,显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活力,同时显著降低丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量和镉离子含量,并且能够促进耐镉基因(OsHMA2、OsHMA3、OsCAL1)的表达。总之,Ospep5通过调节水稻幼苗各种生理生化反应以及调控耐镉基因表达的方式,最终提高水稻幼苗对镉胁迫的耐受性。

氨三乙酸配位辅助原位合成Ni@B-HZSM-5对苯和甲醇烷基化反应的影响

利用氨三乙酸离子(NTA3-)与Ni2+的配位作用在强碱溶液中原位合成了负载B-Ni的HZSM-5分子筛(Ni@B-HZSM-5)。采用X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、X射线荧光光谱(XRF)、低温N_(2)吸附-脱附、吡啶红外光谱(Py-IR)、NH3程序升温脱附(NH3-TPD)和H_(2)程序升温还原(H_(2)-TPR)等手段对Ni@B-HZSM-5催化剂进行了表征,采用固定床反应器评价其苯和甲醇烷基化反应性能,并与浸渍法负载的Ni/HZSM-5分子筛催化剂进行了对比。结果表明:原位合成的Ni@B-HZSM-5催化剂中B和Ni分布均匀,具有丰富的弱酸和适宜的加氢能力,甲醇加氢形成甲烷的副反应在一定程度上被抑制;在温度460℃、H_(2)压力0.4 MPa、n(苯)∶n(甲醇)=1.2∶1和质量空速2 h^(-1)条件下,4%Ni@B2-HZSM-5催化苯和甲醇烷基化反应,苯转化率可达46.4%,甲苯和二甲苯总选择性达到95.9%,其中C8芳烃选择性为35.1%,C8芳烃中乙苯摩尔分数为6.1%;并表现出优异的稳定性,比浸渍法Ni/HZSM-5分子筛催化剂性能更佳。

SOX5对大鼠成骨细胞增殖及核因子-κB信号通路的影响

目的:探究Y-box蛋白5(SOX5)对大鼠成骨细胞(OB)增殖及核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:取新生24 h SPF级SD乳鼠,应用酶消化法分离大鼠颅骨OB。形态学观察和ALP染色鉴定成骨细胞;取生长良好的第4代OB,分为空白对照组、pcDNA3.1组、pcDNA-SOX5组、si-NC组、siRNA-SOX5组。转染48 h后qRT-PCR检测细胞中SOX5 mRNA的表达;MTT法检测细胞增殖活力;ALP活性检测试剂盒测量ALP活性;茜素红染色观察钙结节的形成情况;Western blotting检测OB分化及NF-κB信号通路相关蛋白Runt相关转录因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、NF-κB p65及其磷酸化蛋白、KB抑制蛋白激酶α(IκBα)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果:与空白对照组相比,pcDNA-SOX5组大鼠OB中SOX5 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.05),OB增殖活力、ALP活性、钙化结节数量和面积、Runx2、CollagenⅠ、IκBα表达显著降低(P<0.05);siRNA-SOX5组大鼠OB中SOX5 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.05),OB增殖活力、ALP活性、钙化结节数量和面积、Runx2、CollagenⅠ、IκBα表达明显升高(P<0.05)。结论:SOX5具有调控OB增殖、分化的作用,其作用机制可能与调控NF-κB信号通路有关。

miR-181c-5p调控BIRC5对前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-181c-5p对前列腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法通过TCGA数据库中前列腺癌数据分析BIRC5、miR-181c-5p与前列腺癌病理关系,采用miRNA靶基因预测数据库分析miR-181c-5p与BIRC5靶结合位点并使用双色荧光素酶活性实验验证,Western blot检测miR-181c-5p过表达细胞中BIRC5蛋白表达。以前列腺癌细胞PC3、DU145为研究背景,构建miR-181c-5p过表达细胞系(miR-181c-5p组)及其阴性对照(miR-NC组)并用qRT-PCR验证,CCK-8法检测细胞增殖情况[450 nm处光密度值(OD_(450 nm)值)],流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率,Western blot检测细胞增殖、凋亡相关蛋白表达。建立miR-181c-5p/BIRC5双过表达调细胞系(miR-181c-5p+BIRC5组),用上述相同方法检测细胞生长、细胞周期分布、细胞凋亡率及相关蛋白表达。结果BIRC5在前列腺癌组织表达升高且在肿瘤高侵犯程度、淋巴结转移和复发患者呈现更高表达趋势,BIRC5高表达患者生存情况较差;miR-181c-5p在前列腺癌癌组织表达降低,miR-181c-5p水平与BIRC5水平呈负相关,miR-181c-5p靶向抑制BIRC5表达。在PC3、DU145细胞中,miR-181c-5p组细胞miR-181c-5p水平高于miR-NC组(P<0.05),OD_(450 nm)值和S期细胞百分比低于miR-NC组(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞百分比、细胞凋亡率和BAX、caspase-3、PARP蛋白表达高于miR-NC组(P<0.05),CDK2、CCNB1、BCL-2蛋白表达弱于miR-NC组(P<0.05)。miR-181c-5p+BIRC5组细胞的BIRC5蛋白表达和OD_(450 nm)值高于miR-181c-5p组(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞百分比低于miR-181c-5p组(P<0.05),S期细胞百分比高于miR-181c-5p组(P<0.05),细胞凋亡率低于miR-181c-5p组(P<0.05),CDK2、CCNB1和BCL-2蛋白表达高于miR-181c-5p组,BAX、caspase-3、PARP蛋白表达低于miR-181c-5p组。结论miR-181-5p可以靶作用BIRC5抑制人前列腺癌细胞增殖,使细胞周期在G_(0)/G_(1)期阻滞,促进细胞凋亡。

A10-057与FG5X-265对超导重力仪格值标定结果的对比分析

采用最小二乘与迭代算法,对A10-057绝对重力仪、FG5X-265绝对重力仪及iGrav-053超导重力仪的同期同址观测数据进行处理,得到FG5X-265及A10-057精密测定iGrav-053的格值因子分别为-883.9294 ns^(-2)/V、-884.134 ns^(-2)/V,标定精度为0.04826%、0.0937%,均优于0.1%。同时对比FG5X-265与A10-057在标定工作中各项测量指标与选取测量对数对标定结果的影响,通过列举多场景对格值精度的要求,最终证明A10型绝对重力仪具备标定相对重力仪的能力,为后续相对重力仪标定工作提供参考。

海马ICAM5对小鼠饮酒行为的影响及机制研究

目的 分析小鼠海马组织中ICAM5对小鼠饮酒偏好、运动能力等行为的影响,并分析其可能的作用机制。方法 选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机将小鼠分为饮水组和饮酒组,建立双瓶饮酒模型。检测ICAM5在小鼠内侧前额叶皮层、海马及杏仁核脑区的表达改变。构建ICAM5过表达腺相关病毒,通过脑立体定位方法注射至海马脑区。通过免疫荧光技术和Western blot检测海马组织ICAM5的蛋白表达水平。通过旷场实验、条件位置偏爱实验和翻正反射实验,观察小鼠对酒精的偏好性以及ICAM5对小鼠行为的影响。通过Western blot检测分析树突棘F-actin/G-actin比值,高尔基染色方法检测树突棘形态。结果 在双瓶饮酒模型中,与饮水组相比,饮酒组小鼠海马脑区ICAM5的表达显著下降(P<0.001)。结果显示,通过荧光显微镜观察到ICAM5在小鼠海马脑区特异性表达。在旷场实验中,AAV-ICAM5组小鼠较对照组小鼠在旷场中心位置停留时间(P<0.01)和运动距离明显增加(P<0.001)。在CPP实验中,测试期AAV-ICAM5小鼠在伴药箱的停留时间较对照组小鼠明显降低(P<0.001)。在LORR实验中,过表达ICAM5可以明显降低小鼠镇静潜伏期(P<0.01),但同时显著缩短镇静作用的持续时间(P<0.001)。与AAV-mCherry+Water组相比,饮酒后小鼠海马F-actin/G-actin比值显著升高(P<0.01),而ICAM5过表达后这一比值显著降低(P<0.001)。与AAV-mCherry+Water组相比,饮酒后小鼠海马CA1区树突棘密度增加(P<0.001),但是AAV-ICAM5+Alcohol组树突棘密度显著降低(P<0.01)。结论 海马ICAM5可能通过调节细胞骨架蛋白的表达,形成树突棘结构可塑性改变,最终引起小鼠饮酒和运动行为的改变。

蒙药经典方剂肉豆蔻-5对心肌梗死的保护作用及机制研究

目的探讨蒙药经典方剂肉豆蔻-5对心肌梗死(MI)模型大鼠的保护作用及机制。方法将50只大鼠分为空白对照组(A组),模型对照组(B组),肉豆蒄-5高、中、低剂量干预组(C1组、C2组、C3组),各10只。除A组外,B组、C1组、C2组、C3组大鼠通过冠脉左前降支(LAD)结扎构建MI模型。C1组、C2组、C3组大鼠分别灌胃0.27,0.54,1.08 g/kg肉豆蔻-5,A组和B组大鼠灌胃等量羧甲基纤维素钠。通过检测大鼠左室射血分数(LVEF),心肌组织2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、Masson染色及外周血心肌损伤标志物肌酸激酶脑型同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平,评价肉豆蔻-5对MI模型大鼠的保护作用。对大鼠心肌组织进行蛋白质组学检测及蛋白基因集富集分析(GSEA),明确肉豆蔻-5保护MI的作用机制。结果与B组比较,C1组大鼠的LVEF均显著升高(P<0.05);C1组、C2组大鼠的LDH和CK-MB水平均显著降低(P<0.05),心肌梗死面积占比显著缩小(P<0.05),心肌纤维化程度显著降低(P<0.05)。心肌组织蛋白质组学检测结果显示,与B组比较,C1组大鼠心肌组织中分别有522个和270个蛋白显著高表达和低表达(P<0.05)。维恩图显示,肉豆蔻-5能逆转MI模型大鼠心肌组织中169个蛋白而发挥对MI的保护作用。169个蛋白GSEA结果显示,代谢通路、氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪肝通路、阿尔茨海默病通路、帕金森病通路被显著富集(P<0.05),其中代谢通路(EnrichmentScore=0.4538,P=0.0037)和氧化磷酸化通路(EnrichmentScore=0.4928,P=0.044)与心脏功能密切相关。结论肉豆蔻-5对MI的保护作用与调控心肌代谢有关。

瞬时受体电位通道5对间歇性低氧致心肌焦亡的影响

目的探讨瞬时受体电位通道5(TRPC5)对间歇性低氧致心肌焦亡的影响。方法TRPC5^(-/-)大鼠及SD大鼠各12只,两种大鼠分别随机分为慢性间歇性低氧组(CIH组)和常氧组(Control组),即WT-Control组、WT-CIH组、TRPC5^(-/-)-Control组、TRPC5^(-/-)-CIH组,每组6只。通过Masson染色观察大鼠心肌纤维化情况,ELISA检测血清炎症因子水平,Western blot检测TRPC5及焦亡相关蛋白相对表达水平。结果Masson染色显示,TRPC5^(-/-)-CIH组胶原容积分数高于TRPC5^(-/-)-Control组,低于WT-CIH组。ELISA结果显示,TRPC5^(-/-)-CIH组血清IL-1、IL-6、TGF-β水平高于TRPC5^(-/-)-Control组,低于WT-CIH组。Western Blot结果显示,TRPC5^(-/-)-CIH组焦亡相关蛋白Caspase-1、NLRP3、GSDMD、GSDMD-N相对表达量高于TRPC5^(-/-)-Control组、低于WT-CIH组。结论TRPC5缺乏减轻间歇性低氧导致的心肌焦亡,并改善心肌纤维化。

骨形态发生蛋白5对肝癌细胞生物学行为的影响及机制

目的 探究骨形态发生蛋白5(BMP5)对人肝癌细胞生物学行为的影响及机制。方法 将正常人肝细胞系L02与人肝癌细胞系Hep3B、Huh7置于37℃、5%CO_(2)细胞培养箱中培养,采用RT-qPCR法检测正常人肝细胞系L02与人肝癌细胞系Hep3B、Huh7中BMP5 mRNA表达。将肝癌细胞系Hep3B、Huh7分为对照(NC)组及低、中、高剂量组,低、中、高剂量组分别用1、10、100 ng/mL浓度的重组人骨形态发生蛋白5(rh-BMP5)处理细胞,通过CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,Western blotting法检测增殖细胞核抗原PCNA和SMAD通路关键蛋白及其磷酸化(SMAD3、p-SMAD3)表达。结果 与正常肝细胞系L02相比,BMP5在肝癌细胞系Hep3B、Huh7中表达升高(P均<0.05)。与NC组相比,中、高剂量组rh-BMP5可促进Hep3B、Huh7细胞增殖和PCNA表达上调(P均<0.05),高剂量组100 ng/mL的rh-BMP5处理肝癌细胞24及48 h细胞凋亡率降低、迁移率增高(P均<0.05)。高剂量组与NC组相比,p-SMAD3表达升高(P<0.05)。结论 BMP5在肝癌细胞系中高表达,可能通过增强SMAD3活化促进肝癌细胞Hep3B、Huh7的增殖、迁移并抑制凋亡。

线粒体酸5对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的保护作用

目的探讨线粒体酸5(mitochonic acid 5,MA5)对阿霉素(doxorubicin,DOX)引起的心肌细胞损伤的保护机制。方法采用DOX处理的H9c2为细胞损伤模型,细胞分为:CON组(正常组)、DOX(1μmol/L DOX处理心肌细胞24 h)组、DOX+MA5组[1μmol/L DOX+MA5(1、5、10μmol/L)作用心肌细胞24 h]、CON+MA5(10μmol/L)组(10μmol/L MA5加入心肌细胞处理24 h)。免疫印迹法检测凋亡(Bax、Bcl-2、cleaved caspase3、cleaved caspase9)、焦亡(NLRP3、Caspase-1、IL-18)及炎症相关蛋白[核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6]表达水平变化。结果与CON组相比,DOX组心肌细胞炎症相关蛋白(NF-κB,TNF-α,IL-1β,IL-6)表达上调,给予MA5(5、10μmol/L)处理后,炎症相关蛋白的表达受到明显抑制(P<0.05)。DOX组较CON组焦亡相关蛋白(NLRP3、Caspase-1、IL-18)表达量明显升高(P<0.05),而给予MA5(5、10μmol/L)处理后,焦亡相关蛋白的表达量明显减低(P<0.05),促凋亡蛋白表达量明显下降(P<0.05),抑制凋亡蛋白表达量上升(P<0.05)。结论MA5可能通过抑制DOX诱导的细胞炎症、焦亡和凋亡作用从而对DOX心脏毒性产生保护作用。

牛中性粒细胞β防御素5对肺炎克雷伯菌感染小鼠的预防作用

为探究牛中性粒细胞β防御素5(bovine neutrophilβ-defensins 5,BNBD5,B5)对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)感染小鼠的保护作用,将40只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组,B5处理组,KP感染组和B5预处理后感染KP组,每组10只。HE染色观察肺组织病理变化,ELISA检测肺脏TNF-α和IL-1β水平,涂板法检测肺脏和脾脏的细菌载量,流式细胞术检测肺脏巨噬细胞和中性粒细胞。结果表明,鼻内给予B5未引起肺脏病理损伤,未诱导肺脏产生过量TNF-α和IL-1β。B5能减轻KP引起的肺组织病理损伤,显著减少肺脏和脾脏中的细菌载量;增加肺组织中的巨噬细胞和中性粒细胞,明显上调肺组织TNF-α水平。表明鼻内给予B5能保护KP感染小鼠。

基于改进YOLOv5对果园环境中李的识别

为提高果园中高遮挡和密集的李(Prunussalicina Lindl.)的检测精度,提出一种改进YOLOv5s模型,在促进模型轻量化的同时提高模型对李的检测精度。首先,使用新的结构Focus-Maxpool模块替换主干网络中的下采样卷积,使改进模型在下采样时能够保留更多高遮挡目标和小目标的特征信息。其次,使用focal loss和交叉熵函数的加权损失作为改进模型的分类损失,提升改进模型对粘连目标的识别能力。最后,设计若干组检测试验来评价改进模型的性能。结果显示,改进YOLOv5s模型的平均精度优于YOLOv5s、YOLOv4、Faster-RCNN、SSD和Centernet;与YOLOv5s模型的检测结果相比,改进YOLOv5s模型的平均精度、召回率和精度分别提高2.84、9.53和1.66百分点,检测速度可达到91.37帧/s,能够满足实时检测需求。研究结果表明,改进的YOLOv5s模型在真实果园环境下具有较高的检测精度和鲁棒性。

基于转录组学探究GIMAP8和SEC14L5对肺纤维化发展的影响

目的 基于转录组学测序技术,观察肺纤维化进程中GIMAP8和SEC14L5在尘肺患者和矽肺小鼠模型中的表达变化,为阐明肺纤维化的发生和发展提供理论依据。方法 将雄性C57BL/6小鼠随机分为PBS组(磷酸缓冲盐溶液)和Silica组(二氧化硅悬液),通过非暴露式气管插管方式在第0、14天向Silica组小鼠灌注100 mg/mL二氧化硅悬液50μL,PBS组灌注等量磷酸缓冲盐溶液。第28天时评估小鼠肺功能并处死所有小鼠,进行肺组织形态观察、纤维化评价以及mRNA水平的检测。结果 与健康对照者相比,尘肺患者筛选出有显著表达差异的mRNA共584种,其中242种mRNA显著上调,342种mRNA显著下调。富集分析显示,这些差异表达的mRNA主要参与了P53、NF-κB、TNF、AMPK等信号通路。PBS组小鼠肺结构正常,而Silica组小鼠呈现肺泡结构破坏,胶原纤维沉积和纤维团块。肺组织中GIMAP8表达上调,SEC14L5表达下调。Silica组小鼠肺功能有所下降。结论 在尘肺患者及矽肺小鼠模型中,GIMAP8和SEC14L5可能参与肺纤维化的发生和发展,这可能为预防和治疗这些疾病提供分子理论基础。

马铃薯块茎变绿中StHY5对龙葵素合成的促进作用

【目的】马铃薯因采后贮藏、运输及货架摆放等因素,容易造成块茎“绿变”,导致块茎中SGAs大量累积,而HY5是植物中光信号的重要传递因子,研究其在块茎变绿中的作用,为马铃薯采后环节因光照导致的龙葵素积累提供分子基础。【方法】通过基因表达分析、转录组分析、靶向代谢物分析、亚细胞定位、酵母单杂交、双荧光素酶等试验,阐明StHY5在光照后块茎变绿中的作用。【结果】StHY5在薯皮和薯肉中均有表达,但表达模式不同;绿变处理后,薯肉中StHY5的表达水平和SGAs含量的变化一致,与此同时,龙葵素合成基因StSGT1/GAME1和StGAME4表达显著上调;酵母单杂交试验和双荧光素酶试验证明,StHY5可以直接结合StSGT1/GAME1和StGAME4的启动子并激活其表达。【结论】在马铃薯绿变过程中,StHY5通过直接上调StSGT1/GAME1和StGAME4的表达,从而促进SGAs的积累。

S1PR5对脂多糖诱导小鼠认知行为和炎症反应的影响及其抗炎机制

目的:探讨鞘氨醇1-磷酸受体5(S1PR5)对脂多糖(LPS)诱导的神经炎症、认知行为的影响,及对BV2细胞的抗炎作用及相关机制。方法:(1)使用C57BL/6野生型(WT)小鼠和同背景S1PR5基因敲除(knockout,KO)小鼠,按照随机数字法分为WT对照组、WT-LPS组、S1PR5 KO对照组和S1PR5 KO-LPS组。WT-LPS组和S1PR5 KO-LPS组小鼠分别经单次腹腔注射5 mg/kg LPS构建神经炎症模型。WT对照组和S1PR5 KO对照组注射等量生理盐水。造模7 d后进行Morris水迷宫实验,之后收集各组小鼠脑组织,尼式染色观察海马组织变化;RT-qPCR检测海马组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6的mRNA表达水平。Western blot和组织免疫荧光检测海马组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的表达。(2)以LPS刺激BV2细胞诱导炎症反应并用A971432激动S1PR5或慢病毒过表达S1PR5进行干预,通过RT-qPCR法分别检测激动或过表达S1PR5对S1PR5、IL-1β、IL-6、TNF-α及CD206的影响;细胞免疫荧光法检测CD206的表达;Western blot法检测CD206、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环加氧酶2(COX2)、NLRP3、p-NF-κB、cleaved caspase-1和IκBα的蛋白水平。结果:(1)体内实验发现,S1PR5 KO可显著增加LPS诱导的小鼠记忆缺损、海马区IL-1β和IL-6的mRNA表达及NLRP3蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。(2)BV2细胞中S1PR5的表达不具有A971432浓度依赖性及时间依赖性。(3)激动S1PR5或过表达S1PR5可在mRNA水平上显著降低LPS诱导BV2细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α,增加CD206的表达(P<0.05或P<0.01);可在蛋白水平上显著增加M2型巨噬细胞标志蛋白CD206,降低M1型巨噬细胞标志物iNOS和COX2的表达(P<0.05或P<0.01);可显著降低NLRP3、p-NF-κB和cleaved caspase-1的表达,增加IκBα的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:(1)S1PR5缺失通过促进神经炎症反应加重了LPS诱导的小鼠认知障碍。(2)激动或过表达S1PR5促进BV2细胞向M2表型极化,抑制NLRP3炎症小体组成成分的表达及NF-κB信号通路,抑制LPS诱导的炎症反应。

Rab5对禽偏肺病毒C型复制影响的研究

为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,脑内Ras类似物5(Rab5)对病毒复制的影响,本研究将重组质粒p GFP-Rab5和负显性突变的Rab5(pGFP-Rab5-DN)分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的a MPV/C感染该细胞,48 h后进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示Rab5、Rab5-DN和aMPV/C N蛋白均分布于细胞质中,且Rab5与aMPV/C N蛋白存在明显的共定位。进一步采用Image J软件对细胞内的荧光强度分析后发现,Rab5与aMPV/C N蛋白存在多处共定位,而Rab5-DN与aMPV/C N蛋白无明显共定位,表明Rab5参与aMPV/C的复制。将p CMV-Flag-Rab5和p CMV-Flag分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、荧光定量PCR(qPCR)检测a MPV/C N基因转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染p CMV-Flag的细胞相比,转染p CMV-Flag-Rab5的细胞中Rab5的表达水平明显升高;此外,p CMV-Flag-Rab5转染组中的aMPV/C N蛋白表达水平和N基因的转录水平均极显著升高(P<0.01),病毒效价显著升高(P<0.05)。表明,过表达Rab5促进aMPV/C的复制。将siRab5和siNC分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、q PCR检测aMPV/C N基因的转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染si NC的细胞相比,转染siRab5的细胞中Rab5的表达水平明显降低;同时,siRab5转染组中aMPV/C N蛋白的表达水平和N基因的转录水平均极显著降低(P<0.01),病毒效价显著降低(P<0.05)。表明,干扰Rab5表达可抑制aMPV/C的复制。将p CMV-mcherry-Rab5与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒分别转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察发现Rab5蛋白与aMPV/C N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3蛋白均在细胞质中存在荧光信号重叠,但该蛋白与L4蛋白无该现象,表明Rab5蛋白可与多个aMPV/C蛋白共定位。将p CMV-Flag-Rab5分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒共转染HEK293T细胞,48 h后采用Co-IP试验检测Rab5与不同aMPV/C结构蛋白的相互作用。结果显示,IP样品中表达G和L2蛋白的位置出现了特异性条带,而其他蛋白无条带,表明Rab5与aMPV/C G和L2蛋白存在互作。上述结果首次证实,Rab5通过与aMPV/C多个蛋白(G和L2)的互作参与aMPV/C的复制机制。本研究为阐明Rab5调控aMPV/C复制的分子机理提供研究借鉴。

HES5对肾小管上皮细胞转分化和凋亡的影响及其机制研究

目的探讨HES5(hairy and enhancer of split 5)对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用及其潜在机制。方法分析和筛选GSE66494数据中的差异表达基因。建立小鼠的输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction,UUO),检测肾组织中HES5的表达水平。TGF-β1(10 ng/mL)处理HK-2细胞24 h建立肾小管上皮-间质转化模型后,通过qRT-PCR和Western blot检测HES5的表达水平。用过表达HES5的质粒转染HK-2细胞,24 h后检测其纤连蛋白(Fibronectin,FN)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)及凋亡相关标志物(Bax、Bcl2)等蛋白表达;然后,将HK-2细胞分为4组:Control组、siHES5组、TGF-β1组、siHES5+TGF-β1组,检测各组的纤维化及凋亡标志物的表达情况。运用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot检测各组AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。通过加入PI3K抑制剂(LY294002)处理过表达HES5的HK-2细胞后,检测Vimentin的表达。结果HES5的表达在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和小鼠纤维化肾组织中均显著上调;过表达HES5可以促进HK-2细胞中FN、CollagenⅠ、Vimentin、Bax的合成,抑制Bcl2的表达(P<0.05);敲低HES5不仅下调纤维化标志物的表达,还抑制了肾小管上皮细胞凋亡;此外,HES5基因敲低使TGF-β1诱导的HK-2细胞内PI3K/AKT信号通路的激活程度降低(P<0.05);PI3K/AKT信号通路抑制剂减弱了HES5对Vimentin的诱导作用。结论敲低HES5可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡,这可能与PI3K/AKT信号通路活性降低有关。

过表达同源盒A5对人甲状腺癌细胞增殖的影响及作用机制

目的:探讨同源盒A5(HOXA5)对人甲状腺癌TPC1细胞生物学功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用RT-qPCR和免疫印迹分析人甲状腺癌TPC1细胞中的HOXA5 mRNA和蛋白表达水平。采用慢病毒转染技术将阴性对照质粒(OE-NC)和HOXA5过表达质粒(OE-HOXA5)转染至TPC1细胞,并验证转染效率;CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、克隆形成及细胞周期;免疫印迹检测增殖相关蛋白及AKT通路相关蛋白的表达水平。结果:与甲状腺滤泡上皮细胞相比,甲状腺癌TPC1细胞中的HOXA5 mRNA和蛋白表达水平明显降低。上调HOXA5表达后,TPC1细胞的增殖活性和克隆形成能力明显受到抑制,细胞在G0/G1期的细胞百分比显著增加,但在S期的细胞百分比下降;且增殖相关蛋白Ki67、c-Myc及AKT信号通路关键蛋白p-GSK3β、p-AKT表达水平明显下调。结论:HOXA5在甲状腺癌TPC1细胞中表达下调,且过表达HOXA5基因可抑制甲状腺癌细胞增殖和克隆形成能力,其机制可能涉及AKT信号通路的激活。