5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记实验性牙移动大鼠血管内皮祖细胞的研究

目的探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记大鼠外周血血管内皮祖细胞(EPCs)的最佳标记时间与剂量。方法建立实验性牙移动大鼠模型,密度梯度离心分离大鼠外周血EPCs并体外培养;免疫细胞化学、荧光化学鉴定细胞表面抗原;终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU标记EPCs,并于标记后12、24、48、72、96h检测各组BrdU的标记率,筛选BrdU的最佳标记计量和时间。结果所培养细胞CD34、CD133呈阳性表达,且DiI-ac-LDL、FITC-UEA-1呈双荧光阳性;终浓度为10μmol/L的BrdU标记细胞72h后标记率达(66.8±2.9)%,与5μmol/L组相比差异有统计学意义(P<0.05),与15μmol/L组相比无统计学意义(P>0.05)。各浓度BrdU对细胞均无毒性影响。结论成功分离、培养了实验性牙移动大鼠外周血EPCs;终浓度为10μmol/L的BrdU标记EPCs72h后可获得较高标记率。本实验可为研究EPCs的趋化、分化机制奠定基础。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记肌源性干细胞:最佳浓度及时间

背景:肌源性干细胞移植入动物体内可以修复骨、肌肉、软骨或神经系统的损伤,但要了解其在体内的迁移、增殖及分化的情况,还需要一种有效、安全的标记方法来追踪其在体内的变化。目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞的效果,探讨其最佳标记浓度和时间。方法:采用差速贴壁法体外分离SD大鼠肌源性干细胞,免疫细胞化学染色法鉴定第2代细胞并进行细胞计数。以终浓度5,10,15,20μmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞,检测其最佳标记浓度,免疫细胞化学染色法分析其标记率;通过MTT法、锥虫蓝排斥实验观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷对细胞增殖的影响。结果与结论:免疫细胞化学染色显示肌源性干细胞呈Desmin阳性,阳性率为(85.7±6.0)%;经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的肌源性干细胞与未进行标记细胞在活力和增殖上相比未见明显差异(P>0.05),标记后的肌源性干细胞活细胞率可达(92.3±2.1)%。其中浓度为10,15,20μmol/L标记组标记效果均优于5μmol/L标记组,10μmol/L为最佳工作浓度,最佳标记时间为3d,标记率为(70.9±4.5)%,随时间延长无明显变化。证实应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞后,对细胞的活力及增殖情况无影响,标记率也能达到细胞移植对其示踪的要求。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨

①目的 探讨 5 -溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)标记骨髓间充质干细胞的可行性。②方法 利用密度为 1 .0 73g mL的Percoll分离骨髓的单核细胞 ,以含 1 0 %胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs细胞 ,纯度可达 95 %左右。用BrdU标记骨髓间充质干细胞 2 4、48、72和 96小时后的检测标记率。③结果 随着标记时间的延长 ,标记率逐渐增高 ,标记 72小时后标记率在 85 %以上。④结论 用BrdU标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是 72小时 ,最佳浓度为 1 0 μg mL。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记在喉黏膜干细胞的研究

目的以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,5-BrdU)为标记对小鼠喉黏膜可能存在干细胞进行初步研究。方法选取出生3 d的昆明小鼠36只,随机分为A、B和C组,每组12只。A组小鼠皮下注射100μg/g的5-BrdU,B组小鼠皮下注射50μg/g的5-BrdU,C组小鼠皮下注射生理盐水。第8周后分别处死各组小鼠,并取小鼠喉黏膜进行免疫组化检测,计算其标记滞留细胞的阳性率。结果 8周后,注射了5-BrdU的A组与B组小鼠喉黏膜鳞状上皮有标记滞留细胞表达但两组间表达无统计学意义(t=0.06,P=0.949)。C组小鼠喉黏膜鳞状上皮无标记滞留细胞表达。结论 A、B两组小鼠喉黏膜存在标记滞留细胞,此标记滞留细胞具有喉黏膜成体干细胞的一些特点,可能是成体干细胞的来源。

E-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿嘧啶的简便合成方法研究

以2'-脱氧尿嘧啶为原料,在糖苷羟基未保护情况下,经过羟甲基化、选择性氧化、Knoevenagel缩合和Hunsdiecker反应等4步反应,简便地合成了抗病毒药物E-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿嘧啶,为工业化生产提供了可靠的依据.

胸腺嘧啶和5-溴脱氧尿嘧啶诱导小鼠白血病细胞同步化

目的；用胸腺嘧啶和５－溴脱氧尿嘧啶联合作用小鼠红白血病细胞，建立白血血病细胞同步化方法。方法：参照遗传学人外周血细胞同步化方法，细胞生长状态好的加入胸腺嘧啶，培养一定时间后加入５－溴脱氧尿嘧啶培养４．５－５小时后加入积水仙素，常规制备中期染色体标本，根据分裂相的多少了解同步化的效率。结果：经诱导后可获得大量中期染色体分裂相。

溴脱氧尿嘧啶核苷体外掺入舌癌的初步研究

目的 :观察溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)标记在肿瘤增殖研究中的价值。方法 :用 80 μg ml的BrdU或碘脱氧尿嘧啶核苷 (IdU)体外掺入Tca8113细胞或舌癌组织 ,标本连续切片与增殖细胞核抗原 (PCNA)表达比较 ;相同孵育时间的细胞与流式细胞术 (FCM)定量S期细胞数比较。结果 :BrdU标记细胞核大浑圆 ,呈散在或姊妹细胞分布 ,子代细胞染色稍淡。BrdU或IdU掺入和PCNA表达之间无显著性差异 (P >0 0 5 )。FCM测定的S期细胞数显著多于BrdU掺入的细胞数 (P <0 0 0 1)。结论 :BrdU标记可用于细胞增殖研究 。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的探讨以5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。在大鼠背部脊柱一侧制作全层皮肤缺损模型,实验组经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107。对照组为5-BrdU标记的BMSC移植的正常大鼠。术后3d、7d、14d、21d、28d分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14d后,大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗BrdU/FⅧ、BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论经尾静脉注射移植的BMSCs参与皮肤创面愈合。

人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞。目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法。设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供。方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记。主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期;绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构。结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%,0.36%,0.64%。人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形。透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物。免疫组织化学检测BrdU标记48h后人骨髓间充质干细胞标记率>80%。结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法;BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法。

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记最佳时间和标记浓度的筛选

背景：骨髓间充质干细胞是目前极具潜力的细胞和基因治疗的宿主细胞。体外标记是追踪其存活、＂归巢＂、生长、分化等一系列过程的前提。目的：探索5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记兔骨髓间充质干细胞的最佳时间和最佳浓度。方法：兔骨髓间充质干细胞取自纯种健康新西兰大耳白兔,通过形态学及流式细胞术鉴定分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。观察不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度标记及不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记时间对兔骨髓间充质干细胞的标记阳性率。结果与结论：流式细胞术检测培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞,生长曲线呈S形。5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物浓度增加而逐渐增高,40μmol/L及72h标记阳性率达85%~95%。结果提示,应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞是安全可靠的,体外标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。

BrdU作为脂肪干细胞标记示踪法的可行性

目的:研究BrdU标记猪脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的最佳剂量及时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:自中华实验猪背部提取脂肪组织,采用贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞以终浓度分别为10、15、20、25及30μmol/LBrdU进行标记;另一孔不含BrdU作为对照组,分别培养12、24、48、72及96h.免疫荧光法检测各组细胞BrdU标记率,找出BrdU的最佳标记方法,通过台盼蓝排斥试验、MTT及细胞凋亡检测,观察BrdU对ADSCs生长情况的影响.对第3代的ADSCs采用最佳标记方法后更换普通培养基继续培养,适时传代,连续检测第4、5、6、7、8代ADSCs的BrdU标记率.结果:原代培养的ADSCs的形态主要为长梭形,第3代ADSCs经BrdU标记后胞核呈红色荧光,随浓度的升高及时间的延长,BrdU阳性标记率逐渐升高,以终浓度20μmol/LBrdU标记48h后阳性率达90%以上,且连续传5代标记率仍达40%.MTT、台盼蓝排斥试验及细胞凋亡检测发现BrdU对ADSCs生长增殖基本无影响.结论:BrdU标记ADSCs的最佳剂量和时间为20μmol/L和48h,该方法标记率高,对细胞影响小,可用于动态研究ADSCs在移植体内生长、分化.

BrdU标记法检测不同年龄阶段小鼠神经前体细胞的增殖潜能

背景:BrdU是胸腺嘧啶核苷类似物,常用来标记前脑室管膜下区具有增殖潜能的神经前体细胞。目的:建立不同年龄阶段BrdU标记方法,系统分析不同年龄阶段神经前体细胞增殖特点以及变化规律。方法:选取胚胎期小鼠、新生小鼠、成年小鼠和老年小鼠各5只,腹腔注射BrdU,观察不同年龄阶段神经前体细胞增殖潜能及不同年龄阶段前脑衰老细胞,探讨微环境对神经前体细胞增殖潜能的影响。结果与结论:胚胎期小鼠、新生小鼠、成年小鼠和老年小鼠前脑室管膜下区BrdU+细胞分别为(897.20±22.38),(262.17±26.26),(76.67±5.63),(43.8±2.61)个,随年龄增加细胞增殖潜能逐渐降低(P<0.05)。成年小鼠和老年小鼠脑室周围有大量β-半乳糖苷酶染色阳性衰老细胞,说明随年龄增加脑内β-半乳糖苷酶染色活性增强,衰老细胞逐渐增多,神经前体细胞生存微环境失衡可能与神经前体细胞增殖潜能下降有关。

BrdU标记人脐带间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)标记人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)的方法及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。方法:将h UC-MSCs分离培养并进行细胞表面标志物及多向分化潜能鉴定,取第5代细胞以终浓度分别为10、15、20、25μmol/L Brd U进行标记,采用空白Brd U作为对照组,分别培养24、48、72 h及96 h后,台盼蓝排斥实验检测细胞活力;MTT法检测细胞增殖能力;Annexin V-FITC检测细胞存活率及凋亡率,免疫组化法检测各组标记率。结果:台盼蓝排斥实验检测细胞活力都在96%以上,实验组与对照组比较均无统计学意义(不同浓度组间比较P=0.89,各时间点比较P=0.61,时间与不同浓度的交互作用P=0.89)。MTT结果显示Brd U对细胞增殖无抑制(P>0.05)。不同浓度标记组间细胞增殖率及凋亡率的差异(增殖率F=12.02,P<0.001,凋亡率F=6.14,P=0.009)。结论:Brd U标记h UC-MSCs是安全可靠的,Brd U标记h UC-MSCs的最佳剂量和时间为20μmol/L、72 h,适于h UC-MSCs在临床前实验研究的体内示踪。

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记酵母基因组DNA的方法

胸腺嘧啶类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记技术是一种研究DNA复制、修复等生命过程的有效手段。由于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中缺少胸腺嘧啶核苷酸补救途径,胞外BrdU不能有效的渗入到基因组中,使该技术在酿酒酵母中的应用受到极大制约。通过在基因组中引入单纯疱疹病毒胞苷激酶(HSV-TK)和人类平衡核苷转运蛋白(hENT1)基因,工作建立了BrdU标记酵母基因组DNA的方法。在生长对数中期加入0.2mg/ml BrdU,离体检测法检测发现,标记3h的荧光信号较1h、5h时强;胞内检测法结果显示,标记3h时55.3%的基因组DNA中能够渗入BrdU。该工作为酿酒酵母DNA复制、修复等方面提供了直接有效的研究方法。

人参皂甙Rg3对K562细胞增殖及细胞周期的影响

目的:研究人参皂甙Rg3(ginsenoside,Rg3)对白血病K562细胞的作用及其相关机制。方法:将白血病K562细胞分为对照组和Rg3组,Rg3组包括10、20、40、80、100μg/mL组,培养24、48、72h,四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性(本文结果未列)。再将K562细胞分为对照组和实验组(80μg/mLRg3组),培养24、48、72h,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记实验观察细胞的增殖情况,流式细胞仪分析细胞24h、48h、72h时细胞周期的变化情况。结果:BrdU标记测定显示,免疫细胞化学染色显示白血病K562细胞呈阳性反应,BrdU阳性细胞数分别为:对照组24h(28.4±3.0)、48h(31.4±3.3)、72h(38.1±4.0),Rg3组24h(22.7±2.5)、48h(17.3±2.9)、72h(19.1±1.1),均具有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪检测显示:48hRg3组细胞周期的G2期增高了3.84倍。结论:人参皂甙Rg3可抑制K562细胞增殖,其机制可能与人参皂甙Rg3将K562细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖有关。

BrdU和EGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞的对比研究

目的:研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)和腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的最佳标记时间与剂量,并进行比较。方法:密度梯度离心分离大鼠骨髓MSCs并体外扩增。AdCMV-EGFP分为100、200、400及800 particles/cell四组进行转染;BrdU以终浓度5、10、15μmol/L进行标记。分别于实验第1、3、5、7 d检测两种方法对MSCs的标记率。通过MTT检测两种标记方法对细胞增殖活性的影响。结果:AdCMV-EGFP以100 par-ticles/cell转染未引起MSCs凋亡,转染3d时效率最高(44.4±3.5%);BrdU以10μmol/L、标记3 d的标记率为(75.1±3.1)%。两种方法均不影响细胞增殖。结论:AdCMV-EGFP和BrdU均可高效标记MSCs,根据研究需要不同均可作为高效的MSCs标记方法。

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率>95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论:采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。