水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因的电子克隆及表达

利用电子克隆的基因克隆策略,以拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶AtITL1的cDNA序列为信息探针,在水稻基因组数据库搜索到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR方法克隆得到了水稻编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的基因OsITL1的全长cDNA序列。RNA凝胶印迹分析表明,OsITL1基因的表达在转录水平上受NaCl、干旱及ABA的诱导,OsITL1可能参与了一些非生物胁迫的应答过程,在逆境条件下的基因转录和磷酸肌醇信号转导途径的调控中起重要作用。

多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

花生1,3,4-三磷酸肌醇5/6激酶ITPK家族基因的鉴定和分析

1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶(ITPK)是一种保守的多功能酶,调控磷酸肌醇的代谢过程,广泛存在于动植物和线虫中。本研究从两个野生种花生基因组(Arachis duranensis和Arachis ipaensis)中获得Ad ITPK家族基因7个,Ai ITPK家族基因7个,利用生物信息学手段,系统地分析花生ITPK家族基因生物学特征。结果表明,Ad ITPKs和AiITPKs基因的染色体定位相似,在03号和05号染色体上都分别有2个ITPK家族成员,Ad ITPKs在A01、A08和A10号染色体上各1个,Ai ITPKs在B01、B07和B10号染色体上各1个;花生各ITPK基因含外显子数量在1~10个不等,可编码220~483个氨基酸;进化关系分析显示花生ITPK家族基因可分为3个亚家族;基于保守结构域分析显示,此家族蛋白含有4~6个保守结构基序。两基因组同源基因的二级结构相似性较大,而Ad ITPK5和Ai ITPK5、Ad ITPK6和AiITPK6两对同源基因例外;大部分基因的三级结构皆相似,但Ad ITPK1、Ad ITPK6、Ai ITPK1和Ai ITPK6与其余基因明显不同;花生ITPK家族基因在各器官中表达量不同,在发育前期的种子、根系和根瘤中表达较高。本研究为花生ITPK基因的后续研究奠定理论基础,为明确ITPK对花生生长中的调控作用提供了依据。

PI3K-Akt-eNOS信号通路在三磷酸腺苷后处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用

目的:探讨磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)信号通路在三磷酸腺苷(ATP)后处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:建立兔心肌缺血再灌注模型,随机将动物分为4组:即缺血再灌注组(对照组)、ATP后处理组、磷酯酰肌醇-3激酶抑制剂(Wortmannin)+ATP后处理组(Wortmannin+ATP组)、线粒体ATP依赖性钾通道抑制剂5-羟葵酸(5-HD)+ATP后处理组(5-HD+ATP组)。再灌注结束后,苏木素伊红染色法观察心肌病理组织变化、TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,免疫组化方法检测心肌Bcl-2、Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax比值及磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达。结果 :ATP后处理组心肌细胞核变小及细胞间质水肿程度较对照组明显减轻,Wortmannin+ATP组和5-HD+ATP组心肌细胞核大小及细胞间质水肿程度与对照组相似;ATP后处理组与对照组比较,心肌细胞凋亡指数明显减低,抗凋亡因子Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值升高,差异均有统计学意义(P<0.01);Wortmannin+ATP组和5-HD+ATP组心肌细胞凋亡指数、Bcl-2/Bax比值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);p-eNOS蛋白阳性表达ATP后处理组较对照组和Wortmannin+ATP组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),与5-HD+ATP组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 :ATP后处理可能通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路最终作用于线粒体ATP依赖性钾通道,减少细胞凋亡,减轻兔缺血再灌注损伤。

抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶在小鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用机制研究

目的:探讨Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶(PIKfyve)在小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移中的作用及机制。方法:培养野生型C57BL/6J小鼠原代VSMC,用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)干预VSMC诱导体外的增殖和迁移,用PIKfyve特异性siRNA敲减PIKfyve的表达,用PIKfyve抑制剂YM201636抑制PIKfyve活性,用胰岛素激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)活性。采用Ki-67免疫荧光染色检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,qPCR检测PIKfyve的mRNA表达,Western blot检测PIKfyve、核糖体蛋白S6(S6)、磷酸化(p)-S6^(Ser235/236)、4E结合蛋白1(4EBP1)和p-4EBP1^(Thr37/46)蛋白水平。为探索PIKfyve在血管内皮损伤后内膜增生中的作用,将雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、假手术+YM201636组、颈动脉内皮损伤组和颈动脉内皮损伤+YM-201636组,每组5只,造模后按分组腹腔注射生理盐水或YM201636(2 mg·kg^(−1)·d^(−1)),持续15 d,造模28 d后HE染色检测颈动脉内膜增生程度。结果:PDGF-BB提升了小鼠VSMC中PIKfyve的表达水平(P<0.01),敲减PIKfyve表达或降低其活性显著抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移(P<0.01)。敲减PIKfyve表达或降低其活性抑制了mTORC1活性(P<0.05),胰岛素恢复mTORC1活性后,敲减PIKfyve表达或降低其活性对VSMC增殖和迁移的抑制作用消失(P<0.01)。小鼠颈动脉内皮损伤后PIKfyve的表达增加(P<0.01),降低PIKfyve活性能减轻颈动脉内皮损伤后内膜增生(P<0.01)。结论:PIKfyve可通过增强mTORC1的活性促进小鼠VSMC的增殖和迁移。

磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖的Rac交换因子2在肿瘤中的研究进展

磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖的Rac交换因子2(PREX2)属于Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员,可通过与磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)相互结合抑制PTEN的活性,从而激活磷脂酰肌醇3-羟激酶(PI3K)信号通路,促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭。已有研究表明,PREX2在黑色素瘤、胃癌、骨肉瘤、胶质瘤、肝细胞癌、肺癌及胰腺癌中过表达,PREX2在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用,可能成为肿瘤诊断和靶向治疗的生物标志物。本文主要对PREX2在肿瘤中的研究进展作一综述。

多酶催化合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应体系的构建及优化

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是目前发现的唯一的"活性"硫酸基团供体,在生物肝素酶法硫磺化反应中起到重要作用,但化学合成的成本高。如何大量低成本制备PAPS是实现酶法合成肝素工业化的关键因素。本文克隆表达了酶法合成PAPS的两个酶:三磷酸腺苷(ATP)硫化酶和5’-腺苷磷酰硫酸(APS)激酶。构建了一条体外合成PAPS的途径。首先利用ATP硫化酶将ATP转化生成APS,同时产生副产物无机焦磷酸(PPi),APS再在APS激酶作用下转化生成PAPS。研究了Mg2+浓度、缓冲体系和p H、温度以及无机焦磷酸水解酶(PPase)的添加对该酶反应的影响。通过添加无机焦磷酸水解酶(PPase),极大提高了PAPS的转化率。在最优条件下考察不同ATP浓度下PAPS随时间的积累量变化,发现反应过程中存在底物抑制作用;ATP浓度为50 mmol?L?1时,反应25 h,PAPS的积累量为18.87 mmol?L?1。反应过程中分批补料ATP,能极大提高催化效率。反应11.5 h,PAPS积累量可达20.36 mmol?L?1(10.32 g·L?1),转化率为81.4%。

3-((4-丙基-5-(嘧啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲胺基)-N-(2,6-二氟苯基)苯甲酰胺的合成及结构表征

以3-氨基苯甲酸甲酯为原料,经氨基的亲核取代、肼解、环合、亲核加成等一系列反应合成3-((4-丙基-5-(嘧啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲胺基)-N-(2,6-二氟苯基)苯甲酰胺。借助1H NMR和LC-MS等方法对所合成的中间体和目标产物的结构进行了表征。

Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶在神经发育性疾病中的作用及其机制研究

Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(typeⅠphosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase,PIP5KIs)是体内合成4,5-二磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2]的关键酶,PIP5KIs催化磷酸化4-磷酸磷脂酰肌醇(PI4P)肌醇环上第5位产生PI(4,5)P2[1]。已有研究发现PI(4,5)P2是神经系统发育的重要调节因子[2-4],作为脂质第二信使的前体,PI(4,5)P2被磷脂酶C水解产生两种脂质第二信使:二酰基甘油(DG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)[5],DG激活蛋白激酶C,IP3通过IP3受体使内质网释放Ca^2+而增加细胞内Ca^2+浓度。此外,PI(4,5)P2被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)磷酸化产生脂质第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]而发挥其调控作用。

微小RNA-26b-5p对缺血性心律失常大鼠心房肌细胞L型钙通道的影响

目的探讨微小RNA(miR)-26b-5p对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)信号通路的调控作用以及对缺血性心律失常大鼠心房肌细胞L型钙通道的影响。方法选择SD大鼠72只,按照随机数表法分为假手术组、模型组、LY294002组、阴性对照组、过表达组、联合组,每组12只。各组给予相应干预24h,除假手术组外的其余各组大鼠建立缺血性心律失常模型,假手术组大鼠仅开胸不结扎。建模过程中检测各组大鼠心律失常指标,采用Curtis-Walker评分法进行心律失常评分;荧光定量PCR法检测心房肌细胞中miR-26b-5p表达;全细胞膜片钳技术记录心房肌细胞L型钙通道电流(ICa-L);蛋白印迹法检测L型钙通道α1C亚基(CACNA1C)、钙调蛋白及PI3K/PIP3通路相关蛋白表达。结果与模型组比较,LY294002组大鼠左心室室性期前收缩次数、室性心动过速持续时间、心室颤动持续时间、心律失常评分、心房肌细胞ICa-L峰值密度绝对值、CACNA1C、钙调蛋白表达显著升高,磷酸化PI3K、PIP3、磷酸化蛋白激酶B(Akt)表达显著降低,过表达组大鼠左心室室性期前收缩次数、室性心动过速持续时间、心室颤动持续时间、心律失常评分、心房肌细胞ICa-L峰值密度绝对值、CACNA1C、钙调蛋白表达显著降低,miR-26b-5p、磷酸化PI3K、PIP3、磷酸化Akt表达显著升高(P<0.05)。与过表达组比较,联合组大鼠左心室室性期前收缩次数、室性心动过速持续时间、心室颤动持续时间、心律失常评分、心房肌细胞ICa-L峰值密度绝对值、CACNA1C、钙调蛋白表达显著升高,磷酸化PI3K、PIP3、磷酸化Akt表达显著降低(0.82±0.08vs1.09±0.11,0.91±0.09vs1.17±0.11,0.94±0.09vs1.20±0.12,P<0.05)。结论miR-26b-5p过表达可能通过激活PI3K/PIP3相关信号通路,阻滞缺血性心律失常大鼠心房肌细胞L型钙通道,改善心律失常表现。

PI3K-Akt、mito-K_(ATP)通道及mPTP在阿托伐他汀后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

目的观察阿托伐他汀(ATV)后处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,探讨磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP通道)及线粒体膜通透性转换孔(m PTP)在其中的作用。方法将雄性Wistar大鼠随机分为对照组(I/R组)、阿托伐他汀后处理组(ATV组)、ATV复合PI3K抑制剂LY294002组(ATV+LY294002组)、LY294002组、ATV复合mito-KATP通道抑制剂5-羟葵酸(5-HD)组(ATV+5-HD组)、5-HD组、ATV复合m PTP开放剂苍术甙(ATR)组(ATV+ATR组)、ATR组,乙醇对照组。进行30 min缺血,120min再灌注。观察各组心肌梗死范围,血流动力学指标,肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)含量,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)含量,心肌Akt和磷酸化Akt表达水平。结果 ATV组心肌梗死范围、LDH、CK-MB较I/R组下降(P<0.05),心肌NAD+含量较I/R组增加(P<0.05);ATV+LY294002组、ATV+5-HD组,ATV+ATR组心肌梗死范围、CK-MB、LDH,NAD+较I/R组差异无统计学意义。ATV组较I/R组血流动力学指标改善。Western blot显示ATV组、ATV+5-HD组和ATV+ATR组磷酸化Akt表达较I/R组增加,ATV+LY-294002组、LY-294002组、ATR组、5-HD组磷酸化Akt表达与I/R组相比无增加。结论阿托伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt、促进mito-KATP通道开放,抑制m PTP开放,产生心肌保护作用。

肝X受体激动剂对人THP-1细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1和肝X受体α、β亚型表达的影响

目的 研究肝X受体激动剂3β- 羟基- 5α,6α- 环氧胆烷酸甲酯和进口肝X受体激动剂激动剂T 0 90 1317对THP 1细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1、肝X受体激动剂α和肝X受体激动剂β亚型mRNA表达的影响。方法 应用逆转录—聚合酶链反应检测- 3β- 羟基- 5α,6α- 环氧胆烷酸甲酯和T 0 90 1317作用前后THP 1细胞源性巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1、肝X受体激动剂α和肝X受体激动剂β的mRNA表达,免疫组织化学检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白水平的表达。结果 3β- 羟基- 5α,6α- 环氧胆烷酸甲酯和T 0 90 1317均能显著上调THP 1细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1和肝X受体激动剂α的mRNA表达(P <0 .0 1) ,并呈时间和剂量依赖性;在对肝X受体激动剂β表达的影响方面,低浓度的T 0 90 1317能明显上调肝X受体激动剂β的表达,而3β- 羟基- 5α,6α-环氧胆烷酸甲酯只有在较高浓度时(10 μmol/L)才表现出上调肝X受体激动剂β表达的作用(P <0 .0 5 )。结论 3β羟基- 5α,6α-环氧胆烷酸甲酯以激动肝X受体激动剂α为主,并与T 0 90 1317一样,可上调THP 1细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1和肝X受体激动剂α的表达。

miR-7-5p在三阴性乳腺癌中的作用及其机制

目的探讨miR-7-5p通过磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信号通路对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖、迁移及血管生成的影响。方法利用qRT-PCR检测TNBC组织、癌旁正常组织以及TNBC细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-361和MDA-MB-468)和人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)中miR-7-5p表达水平。将MDA-MB-468细胞随机分为空白对照组、模拟物对照组、miR-7-5p模拟物组、抑制剂对照组、miR-7-5p抑制剂组、miR-7-5p模拟物+pcDNA组和miR-7-5p模拟物+pcDNA-PIK3CD组。CCK-8检测细胞活力;Transwell检测细胞迁移能力;血管拟态实验分析细胞血管生成能力;双荧光素酶实验证实miR-7-5p与PIK3CD的靶向关系;Western blot检测细胞中PIK3CD、血管内皮生长因子(VEGF)、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达。结果miR-7-5p在TNBC组织和细胞系中下调表达(P<0.05)。上调miR-7-5p,细胞活力下降,迁移细胞数减少,血管拟态形成指数及VEGF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR下降(P<0.05);下调miR-7-5p,细胞活力明显升高,迁移细胞数增加,血管拟态形成指数及蛋白VEGF表达增加(P<0.05)。miR-7-5p直接靶向负调控PIK3CD蛋白表达。PIK3CD过表达可逆转miR-7-5p对细胞增殖、迁移、血管生成和PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平的抑制作用。结论miR-7-5p通过靶向下调PIK3CD蛋白表达,抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路激活,进而降低TNBC细胞增殖、迁移及血管生成能力。

用二-2-乙基己基磷酸和P_2O_5混合物从硝酸溶液中萃取Am(Ⅲ)

用二-2-乙基己基磷酸(HDEHP)和P2O5混合物做萃取剂,241Am3+为示踪剂,做了从硝酸溶液中液-液萃取Am的实验研究。完成了硝酸浓度和震荡时间的变化影响241Am3+萃取效率的条件实验。发现P2O5的浓度≥0.0125mol/L时,241Am3+的萃取效率大于98%;震荡时间≥30s,两相便可达到萃取平衡。分别用二乙撑三胺五乙酸(DTPA)-乳酸以及Na2CO3溶液对241Am3+进行反萃取。结果显示Na2CO3溶液能给出很高的反萃效率。而且,在很短的震荡时间内,两相都能达到反萃平衡。

miR-138-5p通过PDK1对人肺癌细胞系H23生物学行为的影响

目的探讨微小RNA-138-5p(miR-138-5p)通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)对人肺腺癌细胞系H23生物学行为的影响。方法以肺腺癌细胞系H23作为研究对象,分别转染miR-NC(对照组)或miR-138-5p(实验组);qRT-PCR与Western blot法检测miR-138-5p、PDK1 mRNA在转染后人肺腺癌细胞系H23中表达水平;双荧光素酶报告基因检测miR-138-5p及基因PDK1之间的靶向关系;MTT法、划痕实验、Transwell实验检测增殖、迁移与侵袭能力。结果qRT-PCR检测H23细胞转染后miR-138-5p mRNA表达水平升高,PDK1 mRNA与蛋白表达下调,荧光素酶报告基因实验提示miR-138-5p可与PDK1的3’-UTR直接结合,与PDK1存在靶向关系。miR-138-5p可抑制H23细胞增殖、迁移和侵袭能力。结论miR-138-5p可通过靶向干扰PDK1抑制人肺腺癌细胞系H23细胞的增殖、迁移与侵袭能力,提示miR-138-5p与PDK1可能是治疗肺癌的潜在靶点。

二苯乙烯苷对冈田酸致NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响

目的:观察二苯乙烯苷(TSG)对冈田酸(OA)诱导致NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响,探讨该化合物抗阿尔茨海默病(AD)的可能机制。方法:以OA诱导NG108-15细胞复制AD细胞模型,采用MTT法检测经TSG低、中、高剂量(50、100、200μmol/L)预处理后的细胞存活率,采用吖啶橙/溴乙锭双染色法检测细胞凋亡情况,采用Western blotting法和逆转录-聚合酶链反应法检测细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白及其mRNA以及Tau、磷酸化Tau(p-Tau)蛋白的表达情况,采用免疫荧光法检测CDK5、GSK3β、Tau蛋白的分布情况。结果:正常对照组细胞形态正常,未见或少见CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布。模型组可见固缩或圆珠状的早期凋亡细胞,且CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布明显增多,其细胞存活率显著降低,CDK5、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量以及p-Tau与Tau相对表达量的比值(p-Tau/Tau)均显著升高(P<0.05或P<0.01)。经TSG预处理后,各给药组早期凋亡细胞和CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布均有所减少,其细胞存活率均显著升高,中、高剂量组细胞CDK5蛋白、p-Tau/Tau以及各剂量组细胞CDK5 m RNA、GSK3β蛋白及其mRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05)。结论:TSG对AD模型细胞具有一定的保护作用,这种作用与其提高细胞存活率,下调磷酸激酶CDK5、GSK3β的蛋白表达和基因转录水平,抑制Tau蛋白的磷酸化有关。

基于IL-6/JAK2/STAT3通路探讨加味三物白散对胃癌裸鼠移植瘤上皮间质转化的抑制作用

目的:研究加味三物白散对胃癌裸鼠移植瘤上皮间质转化(EMT)的抑制作用及与白细胞介素-6(IL-6)/非受体型酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)通路的关系。方法:40只裸鼠随机分成模型组、加味三物白散组、阳性药物组、联合组,每组10只。造模、灌胃干预后,ELISA检测裸鼠血清IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CEA、CA199含量,HE染色观察瘤组织病理改变,RT-PCR及Western Blot检测EMT及IL-6/JAK2/STAT3通路相关mRNA、蛋白表达情况。结果:与模型组比较,各给药组第12—18天瘤体体积显著缩小(P<0.05),镜下肿瘤细胞有坏死区,血清中IL-6、TNF-α、CEA、CA199含量显著降低(P<0.05),瘤组织中JAK2、STAT3、N-cadherin、Vimentin mRNA及STAT3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),E-cadherin mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01,P<0.05);且联合组各m RNA表达效果优于两单给药组(P<0.05)。结论:加味三物白散可通过调控IL-6/JAK2/STAT3信号通路抑制胃癌裸鼠移植瘤EMT,效果以联合用药为优。

1,4,5-三磷酸肌醇3激酶A调控脑胶质瘤细胞增殖、迁移和上皮间质化

目的探讨1,4,5-三磷酸肌醇3激酶A(ITPKA)在脑胶质瘤细胞的表达和功能。方法利用实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)比较SVGP12、U118和U87细胞系(购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)ITPKA mRNA和蛋白表达水平。将U87细胞分为对照组、对照短发卡RNA(shRNA)组和sh-ITPKA组,噻唑蓝法检测转染细胞培养24、48、72、96 h后细胞活性,平板克隆和小室迁移(Transwell)法检测克隆形成能力与细胞迁移能力,Western blot检测ITPKA、波形蛋白、N-钙黏蛋白和E-钙黏蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。结果U118和U87细胞中ITPKA mRNA和蛋白表达水平明显高于SVGP12细胞(mRNA水平:2.81±0.40、3.92±0.19比1.06±0.06,F=94.48,P<0.01;蛋白水平:0.57±0.05、0.66±0.03比0.20±0.01,F=161.30,P<0.01)。培养24、48、72、96 h后,sh-ITPKA组细胞活性明显低于对照组和对照shRNA组(24 h:0.14±0.01比0.19±0.01、0.20±0.02,P<0.01;48 h:0.20±0.01比0.30±0.01、0.30±0.02,P<0.01;72 h:0.26±0.01比0.37±0.01、0.38±0.01,P<0.01;96 h:0.29±0.01比0.45±0.01、0.45±0.01,F_(交互)=17.22,F_(时间)=713.00,F_(分组)=662.60,P<0.01)。sh-ITPKA组细胞细胞迁移数目低于对照组和对照shRNA组(25.40±2.51比41.20±4.66、42.00±5.24,F=23.69,P<0.01)。同时,sh-ITPKA组细胞克隆形成数目明显低于对照组和对照shRNA组(120.60±11.41比215.00±18.73、221.40±14.83,F=68.15,P<0.01)。sh-ITPKA组细胞ITPKA、波形蛋白、N-钙粘蛋白表达水平低于对照组和对照shRNA组,而E-钙粘蛋白表达则高于对照组和对照shRNA组(ITPKA:0.11±0.02比0.70±0.02、0.68±0.03,F=637.00,P<0.01;波形蛋白:1.06±0.07比1.65±0.07、1.60±0.08,F=58.31,P<0.01;N-钙粘蛋白:0.88±0.04比1.15±0.07、1.20±0.03,F=31.56,P<0.01;E-钙粘蛋白:0.85±0.03比0.46±0.04、0.43±0.04,F=116.80,P<0.01)。结论ITPKA在胶质瘤细胞中表达升高,敲低ITPKA表达则抑制胶质瘤细胞恶性行为。

微小RNA-486-5p通过调控缺氧诱导因子-1α/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶A信号通路影响结肠癌的发生发展

目的探讨微小RNA-486-5p(miR-486-5p)通过调控缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(Akt)信号通路影响结肠癌的发生发展。方法脂质体Lipofectamine™3000将miR-486-5p模拟物NC(对照),miR-486-5p模拟物转入SW480结肠癌细胞中,细胞购自上海细胞库。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-486-5p表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p27、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、HIF-1α、PTEN、PI3K及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。组间比较采用t检验进行分析。结果miR-486-5p模拟物组细胞miR-486-5p表达量(1.87±0.09比1.00±0.10,t=5.589,P<0.05)、细胞早期凋亡率[(15.48±0.97)%比(1.47±0.09)%,t=4.327,P<0.05],细胞晚期凋亡率[(27.46±1.54)%比(3.24±0.13)%,t=5.652,P<0.05],细胞周期G1期[(60.32±4.43)%比(24.08±1.96)%,t=4.578,P<0.05]、bax(0.96±0.08比0.18±0.01,t=5.373,P<0.05)、p27(0.86±0.06比0.32±0.01,t=5.762,P<0.05)及PTEN(1.64±0.09比0.46±0.02,t=4.874,P<0.05)蛋白表达量高于对照组,miR-486-5p模拟物组细胞活力(0.33±0.01比0.54±0.03,t=4.582,P<0.05)、细胞侵袭数目[(37.59±2.64)个比(179.93±6.96)个,t=4.147,P<0.05],bcl-2(0.21±0.01比1.04±0.09,t=5.287,P<0.05)、Cyclin D1(0.14±0.00比0.85±0.07,t=4.642,P<0.05)、MMP-9(0.28±0.02比0.84±0.06,t=4.643,P<0.05)、HIF-1α(0.45±0.03比1.53±0.09,t=5.562,P<0.05)、PI3K(0.38±0.01比1.78±0.10,t=5.468,P<0.05)及p-Akt(0.38±0.02比1.10±0.08,t=4.129,P<0.05)蛋白表达量低于对照组。结论上调miR-486-5p表达量可诱导结肠癌细胞SW480凋亡、抑制细胞侵袭、使细胞周期发生阻滞,可能与抑制HIF-1α/PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。