尿嘧啶还原酶抑制剂5-乙炔基尿嘧啶的合成工艺研究

目的合成 5 乙炔基尿嘧啶并进行工艺研究。方法以乙酰乙酸乙酯与原甲酸三乙酯为起始原料 ,缩合得到α 乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯 ,再与尿素环合得到 5 乙酰基尿嘧啶 ,之后通过氯化、水解得到尿嘧啶还原酶抑制剂 5 乙炔基尿嘧啶。结果与结论与文献报道的方法相比 ,该合成路线具有原料价廉易得、反应条件温和等优点。

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性

背景:深入准确地研究骨髓间充质干细胞在体内外增殖、分化的规律,寻找安全、有效、灵敏度高、特异性强、简便的标记活细胞的方法至关重要。目的:探索5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的有效性及对其增殖能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞至第3代。将细胞以5×107L-1浓度接种于96孔板中,掺入法加入终浓度为0,10,20,50μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,分别在培养24,48和72h检测5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记细胞的阳性率、标记后的细胞形态,并绘制标记细胞的生长曲线。结果与结论:各浓度组标记率均随标记时间延长而升高(P<0.05);各时间点标记率随标记浓度的升高而增加,但其差别无显著性意义(P>0.05)。10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。标记前后各组间充质干细胞生长曲线均呈"S"形。说明在实验浓度范围内应用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞有效,不影响细胞的增殖,且10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。

氯甲基苯甲酰氨和5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷标记示踪大鼠脂肪干细胞的研究

目的比较研究氯甲基苯甲酰氨（CM-Dil）和5-乙炔基-2＇-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的体外标记示踪效果，为ADSCs移植治疗勃起功能障碍体内研究寻找最佳的干细胞示踪剂。方法分离和培养sD大鼠ADSCs，分别采用10μmol／LCM-Dil荧光活性染料和50μmol／LEdU标记第4代ADSCs，并通过流式细胞术和荧光显微镜检测标记后第7、14、21、28天细胞阳性率。结果CM-Dil和EdU两者对ADSCs生物学特性均无明显影响。CM-Dil标记ADSCs阳性率达（99．6±0．2）％，第21天后荧光开始衰减，第35天细胞阳性率仍达（64．2＋3．3）％；EdU标记ADSCs阳性率为（87．1±1．8）％，7d后细胞阳性率逐渐降低，第14天后急剧降低，第28天细胞阳性率为（14．4±2．7）％。结论CM-Dil和EdU两者均适用于ADSCs标记示踪，CM-Dil标记具有操作简单、标记阳性率高、荧光持久等优点，适用于长期标记示踪，EdU仅适用于短期标记示踪。

基底前脑巢蛋白免疫反应阳性神经元的来源探索

目的探索基底前脑巢蛋白免疫阳性神经元的来源,为进一步研究巢蛋白免疫阳性神经元的功能及利用巢蛋白表达改善学习记忆能力提供基础。方法用免疫荧光法研究巢蛋白免疫阳性神经元与5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)阳性细胞的关系、用免疫组化法研究巢蛋白免疫阳性神经元与双皮质素阳性神经元的关系。结果 EdU阳性细胞主要分布于海马齿状回及侧脑室的室管膜及室管膜下区的细胞,在内侧隔核、斜角带核等区域无明显的EdU阳性细胞,巢蛋白免疫反应阳性神经元与EdU阳性细胞无共定位表现。双皮质素阳性细胞主要分布于海马齿状回及侧脑室的室管膜及室管膜下区的细胞,巢蛋白免疫反应阳性神经元与双皮质素阳性神经元之间无双标。结论基底前脑巢蛋白免疫反应阳性神经元不是一种新生的神经元,可能是成熟胆碱能神经元的一种功能状态。可能是巢蛋白表达赋予了胆碱能神经元特殊的功能。

EdU在检测细胞增殖中的应用

5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)作为一种胸腺嘧啶核苷类似物,在细胞增殖时可以取代脱氧胸腺嘧啶核苷插入正在复制的DNA分子之中,EdU技术的检测原理是基于乙炔基与一种小分子荧光叠氮化合物探针反应形成稳定的三唑环,该反应是一种被称作"click"化学作用的Cu+催化的环加成作用,基于这一反应可以高效快速地检测细胞增殖,并可以有效地检测处于S期细胞的比例。现就EdU在应用于检测细胞增殖的原理、优越性以及具体应用实例等方面进行综述。

Edu标记的人脐带间充质干细胞在小鼠慢性输卵管炎模型中的分布与定位

目的:观察5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Edu)标记的人脐带间充质干细胞(huc MSCs)在小鼠慢性输卵管炎模型中的分布与定位。方法:用Mo Pn衣原体感染液阴道内注射建立小鼠输卵管炎模型,体外培养人脐带间充质干细胞,用10μmol/L Edu培养液对huc MSCs孵育不同时间(0小时、24小时、48小时、72小时)进行标记,同时检测标记组和未标记组细胞增殖和凋亡情况。感染后4周随机分成huc MSC治疗组及PBS对照组,感染后8周,亚甲蓝通水试验观察小鼠输卵管有无积水、阻塞等慢性输卵管炎表现,病理切片HE染色观察组织形态学改变,荧光共聚焦显微镜下观察Edu标记的huc MSCs移植治疗在小鼠输卵管中的分布与定位情况。结果:实验成功建立了小鼠慢性输卵管炎模型,Edu标记前后的huc MSCs的形态无明显差别,均为成纤维样细胞,细胞增殖及凋亡未见明显影响,细胞生长状态良好。10μmol/L Edu标记huc MSCs孵育48小时即可获得良好的阳性细胞标记率(45.53±1.19)%。Edu标记阳性的huc MSCs主要分别在输卵管间质中。huc MSCs治疗能够缓解输卵管积水、阻塞情况,减轻慢性炎症。结论:在小鼠慢性输卵管炎模型中可观察到Edu标记的阳性huc MSCs,Edu标记技术可用于huc MSCs在小鼠慢性输卵管炎模型中定位的研究。

骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠肝细胞增殖影响的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的机制。方法全骨髓贴壁法培养扩增原代SD大鼠骨髓干细胞，传代培养，形态学、生长曲线及免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞，移植治疗D-氨基半乳糖联合脂多糖致肝衰竭大鼠，观察干预治疗后1d、3d、5d、7d肝组织病理学改变、肝组织PCNA蛋白、CyclinDlmRNA表达量。结果原代培养大鼠骨髓间充质干细胞传代后，形态较均一，为梭形或纺锤形，高表达CD90（94．3％），CD29（99．4％），不表达CD11b／c（5．7％），CD45（3．2％）。骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏组织病理损伤（P〈0．05）。BMSCs治疗组PCNA的蛋白表达高于对照组（P〈0．01）。干预后不同时间点治疗组细胞周期蛋白D1的mRNA表达高于对照组（1．182±0．248VS0．468±0．053、0．858±0．114vs0．218±0．178），差异有统计学意义（P〈0．01）。结论骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏病理损伤，上调细胞周期蛋白DlmRNA的表达，促进肝再生，对急性肝衰竭有治疗作用。

维拉帕米对肝癌细胞株HepG2细胞增殖及迁移的影响

目的探讨钙离子通道阻滞剂维拉帕米(VR)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、DNA合成及细胞迁移的影响。方法在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的VR(0、1、5、10、15、20μg/mL),采用甲基四唑蓝(MTT)法测定VR对HepG2细胞增殖的影响;5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Edu)荧光检测法测定细胞DNA合成期(S期)细胞所占比例;划痕试验测定细胞的迁移距离。结果 MTT结果显示经VR处理24 h、48 h后除1、5μg/mL VR在24 h对细胞无抑制作用外(P>0.05),其余浓度及时间段对HepG2的增殖均有抑制作用(P<0.05),并且相同浓度VR刺激48 h较24 h对HepG2的抑制率增加(P<0.05)。Edu结果显示HepG2经VR作用24 h后,0、1、5、10、15、20μg/mL处理组HepG2的S期细胞所占比例分别为51.5%±3.78%、52.4%±3.26%、53.1%±1.94%、39.6%±4.25%、40.2%±2.67%、42.6%±3.13%。10、15、20μg/mL处理组S期细胞所占比例较1、5μg/mL组及对照组下降(P<0.05),与MTT结果一致。划痕试验结果显示经10、15、20μg/mL VR处理24 h后,与对照组相比,细胞迁移距离缩短(P<0.05)。结论 VR对肝癌细胞株HepG2的增殖及迁移均有抑制作用,VR可能成为肝癌治疗的新靶标。