双黄连注射剂中1,5-二咖啡酰奎宁酸致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的检测双黄连注射剂中1,5-二咖啡酰奎宁酸致敏家兔后血清中特异性抗体效价。方法双黄连注射剂中疑似小分子半抗原物质1,5-二咖啡酰奎宁酸与正常家兔血清体外孵育制备完全抗原,免疫家兔获得特异性抗体。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清的抗体效价。间接竞争ELISA测定血清特异性并绘制抑制曲线。采用兔免疫球蛋白E(IgE)ELISA试剂盒检测各组家兔抗血清中IgE抗体的含量。结果1,5-二咖啡酰奎宁酸浓度分别为0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、1.00 mg/ml、2.00 mg/ml、4.00 mg/ml时效价[吸光度(A值)]对应的分别为0.364±0.020、0.334±0.010、0.322±0.020、0.332±0.010、0.298±0.020,均高于阴性对照组A值(0.095±0.010)。得到回归方程I=0.1952 lgC+0.2734,R2=0.9958,半数抑制浓度(IC50)=33.494 mg/ml。家兔体内产生了外源性IgE型抗体。结论在本实验条件下双黄连注射剂中疑似半抗原物质1,5-二咖啡酰奎宁酸具有致敏性。

1,5-二咖啡酰奎宁酸对MPP^+所致PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨1,5-二咖啡酰奎宁酸(1,5-dicaffeoylquinic acid,1,5-diCQA)对多巴胺能神经元的保护作用及其可能的机制。方法采用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导具有多巴胺能神经元特性的PC12细胞作为帕金森病的体外模型,实验分为正常对照组、MPP+组和1,5-diCQA预处理组,根据1,5-diCQA预处理的浓度,将后者又分为10、20、50、100μmol/L 4组。用MTT法测定各组细胞存活率,酶标仪检测细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,RT-PCR法检测细胞突触核蛋白(α-synuclein)的mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞α-synuclein蛋白表达水平。结果 MPP+(250μmol/L)处理PC12细胞24 h后,与正常对照组相比,细胞存活率下降,ROS生成增多,GSH耗竭;不同浓度的1,5-diCQA预处理可以减轻MPP+导致的细胞损伤,且在一定范围内具有量-效关系;50μmol/L的1,5-diCQA预处理可以显著抑制MPP+诱导的α-synuclein转录和翻译水平的增加。结论 1,5-diCQA对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有浓度依赖性的抑制作用,并抑制α-synuclein的过表达,提示1,5-diCQA对帕金森病细胞模型具有保护作用。

1,5-二咖啡酰奎宁酸在肾上腺嗜铬细胞瘤细胞缺血再灌注损伤中的作用

目的研究1,5-二咖啡酰奎宁酸(1,5-diCQA)对缺血再灌注诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)损伤是否有保护作用。方法用缺糖缺氧4 h/复氧24 h处理PC12细胞作为PC12细胞缺血再灌注的体外模型,实验分为4组:空白对照组、1,5-diCQA(50μmol/L)对照组、缺血再灌注组、1,5-diCQA(50μmol/L)+缺血再灌注组。应用酶标仪测定各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量,荧光显微镜观察并测定细胞内活性氧簇(ROS)含量、线粒体膜电位水平。结果 PC12细胞经缺血再灌注损伤后,与空白对照组比较,细胞LDH释放量及ROS含量显著增加(P<0.05),线粒体膜电位显著下降(P<0.05);1,5-diCQA+缺血再灌注组与缺血再灌注组比较,细胞LDH释放量及ROS含量明显降低(P<0.05),线粒体膜电位显著升高(P<0.05);1,5-diCQA对照组与空白对照组比较,以上3项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论 1,5-diCQA通过减轻氧化应激、保护线粒体功能,减轻缺血再灌注诱导的PC12细胞损伤。

液相色谱-电喷雾离子阱质谱法研究人尿中1,5-二咖啡酰奎宁酸的代谢产物

目的研究健康受试者口服1,5-二咖啡酰奎宁酸后尿液中的代谢产物。方法健康受试者每人口服1,5-二咖啡酰奎宁酸600mg,收集0-24h的尿样,经C18小柱固相萃取纯化后,用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术对人尿中的代谢产物进行分析鉴定。结果在人尿中发现了1,5-二咖啡酰奎宁酸的甲基化、葡萄糖醛酸化及甲基-葡萄糖醛酸化代谢产物共28个。其中,有2个代谢产物结构经标准品对照得到确证。结论甲基化、葡萄糖醛酸化和异构化反应是1,5-二咖啡酰奎宁酸在人体内的3种重要代谢途径。

HPLC法测定线叶旋覆花中1,5-二咖啡酰奎宁酸含量

目的:建立线叶旋覆花中1,5-二咖啡酰奎宁酸(IBE-5)的HPLC测定方法。方法:采用高效液相色谱法,色谱条件:ScienhomeC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-乙腈-5%醋酸(5∶20∶75,V/V/V),流速:0.8ml/min,柱温:25℃,检测波长:327nm。结果:IBE-5在0.3～1.5μg/ml之间与峰面积呈现良好的线性关系,其回归方程为Y=3397.5X-46.92,r=0.9999,平均加样回收率为103.5%,RSD为2.28%(n=3),旋覆花中IBE-5的平均含量为2.35%。结论:该测定方法简便、准确、分离效果好,可用于测定线叶旋覆花中IBE-5的含量。

1,5-二咖啡酰奎宁酸与其四乙酰化物相对生物利用度的研究

目的比较1,5-二咖啡酰奎宁酸与其四乙酰化物在大鼠体内的生物利用度,为目标化合物的筛选和结构优化提供参考依据。方法 Wistar大鼠随机分两组,分别灌胃给予等摩尔数的1,5-二咖啡酰奎宁酸（100 mg/kg）和四乙酰化物（133 mg/kg）。血浆样品经乙酸乙酯萃取后,以乙腈-水（5 mmol/L乙酸铵,pH5.0）为流动相,用Ultimate C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,5μm）分离,采用液相色谱串联质谱法同时监测两个化合物。结果两个化合物均在5~1000 ng/ml范围内呈良好线性关系,精密度、准确度、基质效应、提取回收率等各项指标都满足生物样品测定的要求。四乙酰化物在大鼠体内迅速转化成活性代谢产物1,5-二咖啡酰奎宁酸,血浆中没有检测到四乙酰化物和可能的三乙酰化、二乙酰化和单乙酰化物。以1,5-二咖啡酰奎宁酸的量计算,大鼠口服四乙酰化物与口服1,5-二咖啡酰奎宁酸的相对生物利用度为64%。结论四乙酰化物的生物利用度低于1,5-二咖啡酰奎宁酸,开发口服制剂时1,5-二咖啡酰奎宁酸优于四乙酰化物。

单一内标多控法同步测定杏香兔耳风中绿原酸和3,5-二咖啡酰基奎宁酸的含量

目的建立杏香兔耳风中绿原酸和3,5-二咖啡酰基奎宁酸的一标多控含量测定方法。方法采用HPLC单一内标多控法进行测定,以绿原酸为3,5-二咖啡酰基奎宁酸的参照内标,在328nm处测定3,5-二咖啡酰基奎宁酸相对于绿原酸校正因子,利用校正因子和绿原酸同时测定绿原酸和3,5-二咖啡酰基奎宁酸的含量。结果绿原酸和3,5-二咖啡酰基奎宁酸分别在0.20～2.00μg和0.08～0.80μg范围内与峰面积线性关系良好,平均加样回收率绿原酸为99.07%(RSD=0.77%),3,5-二咖啡酰基奎宁酸为99.26%(RSD=0.98%)。结论该方法准确、操作简单、专属性和重现性良好,可实现只用绿原酸一种对照品同时测绿原酸和3,5-二咖啡酰基奎宁酸的含量。

1,5-二咖啡酰奎宁酸减轻MPP^+所致PC12细胞损伤的机制研究

目的探讨1,5-二咖啡酰奎宁酸(1,5-diCQA)是否通过激活Nrf2而减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)所致的PC12细胞损伤,并对可能的信号通路进行研究。方法采用MPP+处理具有多巴胺(DA)能神经元特性的PC12细胞作为帕金森病(PD)的体外模型。实验分为正常对照组、MPP+处理组、1,5-diCQA预处理+MPP+处理组,为了观察1,5-diCQA预处理的浓度-效应关系,将1,5-diCQA的浓度设为10、20、50、100μmol/L。用CCK8法测定各组细胞存活率,酶标仪检测细胞谷胱甘肽(GSH)水平和活性氧族(ROS)水平,Western blot检测各组细胞的Nrf2蛋白水平。进一步采用siRNA转染沉默Nrf2,加入MAPK家族一系列激酶抑制剂后再检测上述相关指标。结果 MPP+(250mmol/L)处理PC12细胞24h后,与正常对照组相比,细胞存活率下降,GSH耗竭,ROS生成增多,说明PD细胞模型建立成功。不同浓度的1,5-diCQA预处理可以减轻MPP+导致的细胞损伤,且在一定范围内具有量效关系;不同浓度的1,5-diCQA预处理可以明显上调Nrf2蛋白的水平。沉默Nrf2后,1,5-diCQA预处理对MPP+诱导损伤的PC12细胞的保护作用消失,细胞存活率未能回升[MPP+组vs.MPP++1,5-diCQA组:(19.47±1.65)%vs.(21.13±2.85)%,P=0.352 6],GSH水平在Nrf2敲除的PC12细胞中明显下降[NT siRNA组vs.Nrf2siRNA组:(15.05±1.71)nmol/mgprotein vs.(4.31±0.83)nmol/mg protein,P<0.001],且1,5-diCQA预处理对GSH耗竭的逆转效应也消失。对MAPK激酶家族的一系列激酶进行信号通路筛选发现,Erk激酶参与了1,5-diCQA通过激活Nrf2而减轻MPP+诱导的PC12细胞损伤这一过程。结论 1,5-diCQA可浓度依赖性地减轻MPP+诱导的PC12氧化应激损伤。这种保护作用是通过激活Erk激酶,进而激活Nrf2,然后上调细胞内源性抗氧化系统来实现的。

HPLC法测定地胆草中4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量

目的：建立高效液相色谱法测定地胆草中4，5-二咖啡酰奎宁酸含量的方法。方法：色谱柱为AgilentSBC．。柱（250mm×4．6mm，5μm），流动相为乙腈．0．1％磷酸溶液（17：83）；流速为1．0ml·min-1；检测波长为327nm；柱温为30℃，进样量10μl。结果：4，5-二咖啡酰奎宁酸在0．0235—2．3520txg范围内线性关系良好（r=0．9999），平均加样回收率为98．75％，RSD为1．24％（n=6）。结论：所用方法简便、快速、准确，可作为测定地胆草中4，5-二咖啡酰奎宁酸含量的方法。

HPLC法测定贡菊中1,5-二咖啡酰奎宁酸含量

目的:建立贡菊中1,5-二咖啡酰奎宁酸(IBE-5)的HPLC测定方法。方法:采用高效液相色谱法,色谱条件为Scienhome C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-5%醋酸(5∶20∶75),流速1.0mL/min,柱温25℃,检测波长327nm。结果:IBE-5在6.25～200μg/mL之间浓度与峰面积呈现良好的线性关系,回归方程为Y=3784.5X-35.21,r=0.9996,平均加样回收率为103.71%,RSD为2.13%(n=5),测定结果贡菊中IBE-5的平均含量为0.54%。结论:该测定方法简便、准确、可靠,可用于测定贡菊中IBE-5的含量。

梯度逆流色谱分离纯化雪菊中的3,5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁

采用梯度逆流色谱技术快速分离纯化雪菊中的3,5-二咖啡酰奎宁酸和奥卡宁,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶8∶2∶8,2∶8∶4∶6;v/v)为溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,转速800r/min,流速5.0mL/min,检测波长254nm。所得馏分通过电喷雾电离(ESI)质谱和核磁共振谱(NMR)鉴定化合物的结构。从200mg粗提物中一次分离得到两个主要化合物:3,5-二咖啡酰奎宁酸(11.2mg)和奥卡宁(10.7mg),且3,5-二咖啡酰奎宁酸为首次从雪菊中分离得到;经高效液相色谱法分析,其纯度分别为92.82%和97.55%。研究结果表明,应用梯度逆流色谱分离雪菊中的生物活性成分快速高效。

苍耳子不同部位中绿原酸和1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定

目的:通过对不同批号苍耳子刺、去刺苍耳子、苍耳子中主要有效成分绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定,对苍耳子去刺是否会对药效产生影响进行探究。方法:采用HPLC法,色谱柱:Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm,5μm);检测波长:328nm;流速:1.0 ml·min-1;柱温:25℃;进样量:10μl;流动相:A相:乙腈,B相:0.16%磷酸溶液,梯度洗脱对苍耳子不同部位的主要有效成分绿原酸1,5-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定。结果:绿原酸和1,5-二咖啡酰奎宁酸在苍耳去刺果实中含量高,而刺中含量低,苍耳子去刺具有一定的合理性。结论:该方法科学先进,稳定可行,实验结果可靠,为苍耳子须去刺工艺的合理性提供了一定依据。

HPLC法同时测定神农茶颗粒中的夏佛塔苷、异夏佛塔苷、去氧地胆草内酯和4,5-二咖啡酰奎宁酸

目的：建立同时测定神农茶颗粒中夏佛塔苷、异夏佛塔苷、去氧地胆草内酯、4,5-二咖啡酰奎宁酸4个成分的高效液相色谱测定方法。方法：采用Hypersil C18色谱柱（200 mm ×4.6 mm,5μm）；以乙腈-0.025 mol·L-1磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量：1.3 ml·min-1,检测波长：270 nm（夏佛塔苷和异夏佛塔苷）、208 nm（去氧地胆草内酯）、327 nm（4,5-二咖啡酰奎宁酸）,柱温为室温。结果：夏佛塔苷、异夏佛塔苷、去氧地胆草内酯和4,5-二咖啡酰奎宁酸分别在5.850~117.000,4.650~93.000,4.160~83.200,5.470~109.400μg · ml-1范围内线性良好, r 值均大于0.999,平均加样回收率分别为97.70%、96.87%、97.53%、99.29%,RSD分别为1.40%、1.13%、1.69%、1.01%（n=6）。结论：该方法简便,结果准确,可用于神农茶颗粒的含量测定。

双黄连注射剂中1,3-二咖啡酰奎宁酸致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的:检测双黄连注射剂中1,3-二咖啡酰奎宁酸致敏家兔后血清中特异性抗体效价。方法:双黄连注射剂中疑似小分子半抗原物质1,3-二咖啡酰奎宁酸与正常家兔血清体外孵育制备完全抗原,免疫家兔获得特异性抗体。用ELISA法检测抗血清的抗体效价。间接竞争ELISA法测定血清特异性并绘制抑制曲线。采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测各组家兔抗血清中IgE抗体的含量。结果:1,3-二咖啡酰奎宁酸的抗体效价(A)值高于阴性对照组2倍,说明其具有潜在的致敏性。回归方程I=0.170 6lg C+0.317 5,相关系数r=0.985 4,检测限IC10为57.40μg·ml^(-1),半数抑制浓度IC50=8.732 0mg·ml^(-1)。家兔体内明显产生了外源性IgE型抗体。结论:在本实验条件下双黄连注射剂中疑似半抗原物质1,3-二咖啡酰奎宁酸具有致敏性。

HPLC法测定灯盏生脉胶囊中4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的含量

目的：建立HPLC法测定灯盏生脉胶囊中4，5-二-0-咖啡酰奎宁酸的含量测定方法。方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0．1％三氟乙酸（20：80）为流动相；检测波长为327nm。理论塔板数按4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸峰计算应不低于8000。结果：4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸进样量在0．02～0．24μg范围内呈良好线性关系（r=0．9999）。样品平均回收率为99．45％，RSD=2．7％。结论：该法操作简便，结果准确，重现性好，可用于控制灯盏生脉胶囊的质量。

中心切割-二维液相色谱分离清热解毒片(胶囊)中的咖啡酰奎宁酸类成分

目的:讨论清热解毒片(胶囊)中三个咖啡酰奎宁酸类成分的分离及含量分析方法。方法:采用在线的中心切割-二维液相色谱系统解决中药复方中某些由于灵敏度低或者受高浓度组分信号的覆盖而无法分离和定量的问题。双梯度二维液相色谱系统与VWD和DAD联用,一维色谱柱为美国赛默飞公司Accucore C_(18)柱(2.1 mm×100 mm,2.6μm)粒径,二维色谱柱为富士填料的自装C18柱(3 mm×150 mm,3μm)。两维流动相均为乙腈和0.4%磷酸水(含0.1%的三氟乙酸),流速分别为0.4 m L·min^(-1)和1 mL·min^(-1),柱温35℃。结果:3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸及4,5-二咖啡酰奎宁酸的线性范围分别为12.109~0.484 mg·L^(-1)(r=0.9998);2.431~0.24 3 mg·L^(-1)(r=0.9993);0.655~0.131 mg·L^(-1)(r=0.9991)。三个分析物的平均回收率在98.41%~98.16%范围内。且含量测定结果显示:4种剂型(包括硬胶囊、软胶囊、糖衣片、薄膜衣片)的含量均在0.0108~0.4831 mg·g^(-1)范围内。结论:该方法使得清热解毒片(胶囊)中的三个分析物的分离效果得到明显改善,同时在对成分复杂的中药复方制剂的分离纯化方面发挥了重要作用。

二咖啡酰奎宁酸与人血浆阿司匹林酯酶的分子对接

目的考察二咖啡酰奎宁酸类化合物对人血浆阿司匹林酯酶活性的影响。方法 HPLC法测定华法林与人源白蛋白的复合物(PDB ID:1H9Z)表征的阿司匹林酯酶活性。在药物设计平台Maestro(version 8.5)上选用虚拟筛选模块Glide比较二咖啡酰奎宁酸与靶点蛋白活性的差异。运用同源建模和分子对接技术探究药物相互作用模式。结果实验组与对照组酶活性间没有统计学差异。分子对接结果显示1,3-二咖啡酰奎宁酸与阿司匹林酯酶间存在较好的结合抑制效应。结论 1,3-二咖啡酰奎宁酸对阿司匹林酯酶有微弱的抑制作用,3,4-二咖啡酰奎宁酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸对阿司匹林酯酶影响不明显。

基于LC-MS/MS的咖啡酰奎宁酸异构体鉴别方法研究

该文对单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的位置异构体分别进行液相色谱分析和不同碰撞能下的二级质谱分析,并对其质谱裂解规律进行了研究。结果发现,单咖啡酰奎宁酸的母离子377和子离子163在不同碰撞能下其强度发生显著变化,通过377/163的强度比值可区分其位置异构体。377/163比值大小依次为3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸。二咖啡酰奎宁酸的母离子539和子离子377、163在不同碰撞能下其强度发生显著变化,通过539/377、377/163的强度比值可区分其位置异构体。539/377比值大小依次为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸。377/163比值大小依次为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。基于Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18色谱柱,不同梯度下咖啡酰奎宁酸位置异构体的洗脱顺序均为5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。通过色谱保留特征和质谱裂解规律对金银花中咖啡酰奎宁酸的位置异构体实现了准确鉴别。

滨蒿提取物中3种二咖啡酰奎宁酸的含量测定

目的建立滨蒿提取物中3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法。方法采用HPLC法测定,色谱条件:Shim-pack VP-ODS色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.036mol·L^(-1)磷酸二元梯度洗脱;流速:1.0mL·min^(-1);柱温:30℃,检测波长:327nm。结果 3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸分别在0.010 3~0.309,0.009 7~0.291和0.010 5~0.315mg·mL^(-1)范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9);加样回收率分别为99.23%,101.30%和100.63%;RSD值分别为1.59%,0.83%和1.23%(n=6);样品溶液在32h内稳定。结论该方法操作简便,重复性好,可用于滨蒿提取物的质量控制。

5-甲基-3-硝甲基己酸乙酯的合成

以异戊醛和膦酰乙酸三乙酯为原料,1,8-二氮杂二环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)为催化剂,碘化钠为磷酸酯碳负离子稳定助剂,经Horner-Wadsworth-Emmons反应合成了5-甲基-2-己烯酸乙酯(3),收率90%;仍以DBU为催化剂,3与硝基甲烷经Michael加成反应合成5-甲基-3-硝甲基己酸乙酯,收率98%,两步总收率88.2%,其结构经1H NMR和IR确证。