HPLC法同时测定人血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的浓度

目的:建立一种同时测定人体血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷浓度的HPLC法。方法:以肌苷为内标,血浆样品用硝酸银(10%)沉淀蛋白质,采用C_(18)柱,检测波长为266nm,流动相:0.01mol·L^(-1)磷酸盐(用2mol·L^(-1)氢氧化钠溶液调pH为7.0)-甲醇(96∶4),流速1.0mL·min^(-1),柱温为45℃。结果:5-氟尿嘧啶和5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷分别在0.1～20μg·mL^(-1)(r=0.9997)和0.2～40μg·mL^(-1)(r=0.9997)浓度范围内线性关系良好,最低检测浓度分别为5和10ng·mL^(-1),方法回收率分别为98.2%～101.2%、99.5%～102.3%,日内、日间RSD均小于6%。结论:方法灵敏、快速、准确,适用于临床上测定5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的血药浓度及药动学的研究。

5-氟脱氧尿核苷对SPF鸡胚最适浓度的测定及对禽痘病毒的抑制作用

用不同浓度的5-氟脱氧尿核苷(FUdR)接种10日龄SPF鸡胚,每个浓度分别接种5枚鸡胚,0.2 mL/枚,同时,设接种同剂量生理盐水的空白对照SPF鸡胚5枚,置37℃孵化培养。18日龄时全部打开鸡胚,观察鸡胚变化。将试验组鸡胚与对照组相比较,以接种鸡胚全部不出现任何异常变化的药物浓度确定为最适浓度。试验结果表明FUdR对10日龄鸡胚的最适浓度为250μg/mL,此浓度对禽痘病毒(属DNA病毒)的生长有明显的抑制作用。试验表明,以10日龄SPF鸡胚作为试验动物,可以用FUdR鉴定病毒的核酸类型。

抗肿瘤药物2′-脱氧-5-氟尿苷合成研究

目的:合成抗肿瘤药物2′-脱氧-5-氟尿苷。方法:以5-氟尿嘧啶核苷为原料,经丙酰溴酰化溴代得2′-溴代-3,′5′-O-二丙酰基-5-氟尿嘧啶核苷,然后氢化得产物2′-脱氧-3,′5′-O-二丙酰基-5-氟尿嘧啶核苷,最后经皂化合成2′-脱氧-5-氟尿苷。结果:以5-氟尿嘧啶核苷为起始原料经3步反应合成了2′-脱氧-5-氟尿苷。结论:本合成方法工艺简便,原料易得,条件温和,总收率为72.0%,适于工业制备。

注射用脱氧氟尿苷与5-氟尿嘧啶对照治疗恶性肿瘤121例

目的:验证和比较注射用脱氧氟尿苷(5’-DFUR)和5-氟尿嘧啶(5-FU)抗肿瘤疗效和安全性。方法:121例晚期恶性肿瘤患者进行5’-DFUR单药(n=22)或联合化疗(n=99),后者随机分为治疗组(n=54)和5-FU对照组(n=45)。5’-DFUR用法为3000mg·m^(-2),静脉滴注,d1～d5;5-FU用法为750mg·m^(-2),静脉滴注,d1～d5;单药和联合化疗组均给药21～28d为1个周期,2个周期为1个疗程。结果:可评价疗效119例患者,单药组有效率13.6%(3/22),各病种之间差异无显著性。联合化疗中,对照组有效率为11.6%(5/43),治疗组有效率为20.4%(11/54),两组之间差异无显著性,既往治疗与否与疗效无明显相关性。单药组主要不良反应为白细胞下降、恶心呕吐、乏力、腹泻、口腔溃疡等。联合化疗组的不良反应主要为骨髓抑制、恶心呕吐、乏力、神经毒性及口腔黏膜损伤等,治疗组和对照组差异无显著性。结论:5’-DFUR单药和联合其他药物对乳腺癌、胃肠道肿瘤均有一定疗效,但与5-FU对照组之间差异无显著性。

HPLC法测定5’-脱氧-5-氟尿苷制备过程中的尿嘧啶和尿苷

建立了5’-脱氧-5-氟尿苷制备过程中的尿嘧啶和尿苷的高效液相色谱测定方法。在Spherisorb C_(18)(150mm×4.6mm)不锈钢柱上,以乙腈—pH4.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液(2:98)为流动相,尿嘧啶、尿苷和酶催化反应液中其它组分间均能完全分离。此法操作简便,结果准确,尿嘧啶和尿苷的回收率达99.10％～100.4％,重现性好。

5'-脱氧氟尿苷和5-氟尿嘧啶对6株大肠癌细胞的抑制作用

目的:测定大肠癌细胞的胸苷磷酸化酶(dThdPase)蛋白含量,探讨dThdPase与5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)对大肠癌细胞的生长抑制作用的相互关系。方法:采用ELISA法对6株大肠癌细胞系LS174T、CloneA、Col0320、CX-1、Lovo和MIP101进行dThdPase蛋白定量分析,然后进行5’-DFUR、5-FU对6株大肠癌细胞的生长抑制实验。把大肠癌细胞分别接种于96孔培养板的每孔中培养24 h,分别加入2倍梯度稀释的5’-DFUR和5-FU.继续培养96 h后应用MTT分析分别测定5’-DFUR和5-FU对6株大肠癌细胞的半数有效剂量(IC50)。结果:除LS174T检出0.5 u/mg、Lovo检出8.9 u/mg的dThdPase蛋白外,其它4株癌细胞未检出。6株大肠癌细胞均对5-FU高度敏感,其半数有效浓度(IC50)分别为1.52～13.68μmol/L,而5’-DFUR对6株大肠癌细胞的IC50则分别为68.71～528.15μmoL/L,是5-FU的15倍-94倍,差异有显著性(P<0.01)。结论:6株大肠癌细胞很少有dThadPase蛋白表达;每一株大肠癌细胞对5’-DFUR的敏感性均明显低于5-FU。

利用嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌酶法合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究

研究酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的反应条件。利用嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine-nucleosidephos-phorylase,PyPNase)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a+合成5-氟尿苷(5-FUR),考察不同反应条件对转化率的影响;尝试不同反应体系对转化率的影响。结果:(1)最佳转化条件:菌体:0.5WCG/L;UR:10mmol/L;5-FU:45mmol/L;PBS:40mmol/L;T:50℃;pH7.4;t:60min,转化率可达91.27%;(2)以Na2SO4溶液为溶剂,比以PBS溶液为溶剂的转化率略有提高。微生物酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的转化率较高,可考虑用于工业生产。

5’-脱氧氟尿苷联合干扰素对转染TP基因结肠癌细胞株裸鼠实验模型的影响

背景与目的:人结直肠癌细胞基本无胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)表达。本实验主要探讨人结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠肿瘤组织中对抗癌药物5’-脱氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine,5’-DFUR)、氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和干扰素-α2a(interferon-α2a,INF-α2a)干预效果的影响。方法:以慢病毒为载体转染TP基因至结肠癌细胞株LS174T,得到稳定传代的高TP表达株。将96只BALB/c裸鼠分成2组,分别应用野生型及转染TP基因后的LS174T细胞株接种裸鼠背部皮下,制成结肠癌TP低、高表达模型。每组再随机分为6组,分别应用0.9%Na Cl溶液、INF-α2a、5-FU、5-FU+INF-α2a、5’-DFUR和5’-DFUR+INF-α2a干预5 d,2周后处死裸鼠,分离肿瘤称重后,分别应用鼠抗人CD34、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抗PD-ECGF单克隆抗体进行免疫组织化学染色。判定是否有TP表达及对微血管进行计数。结果:在野生型LS174T裸鼠荷瘤模型中,使用抗肿瘤药物的3~6组肿瘤质量与对照组相比均明显降低,抑癌率分别为48%、27%、48%和57%,差异有统计学意义(P<0.05)。其中5’-DFUR组(48%)与5’-DFUR+INF-α2a组(57%)、5-FU+INF-α2a组与5’-DFUR+INF-α2a组(27%与57%)相比,抑癌率差异有统计学意义(P<0.05)。在LS174T-TP细胞株裸鼠模型中,5’-DFUR组和5’-DFUR+INF-α2a组抑癌率分别为27%和48%,而使用5-FU的两组未显示出良好的抗肿瘤效果(7%和3%)。免疫组织化学染色显示,野生型LS174T接种形成的肿瘤组织中TP表达阴性,微血管数目较少,而转染TP基因后,肿瘤组织中TP表达明显上升,微血管密度明显增多(P<0.05)。结论:结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠实验肿瘤模型中,TP表达明显增加,使细胞内激活抗癌药物5’-DFUR的抗癌作用明显增强,联合应用INF-α2a能进一步增强这种抗癌作用。而转染TP基因或联合应用INF-α2a对常规抗癌药物5-FU的抗癌效果无明显影响。

2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺改进

目的:改进2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺。方法:参照文献方法,以氟尿嘧啶为起始原料,经硅醚化、缩合、溴化、氢化和皂化等工艺合成2'-脱氧-5-氟尿苷,并对其关键步骤进行了改进。结果:该合成工艺对2'-脱氧-5-氟尿苷有较高的收率,总收率为34.31%。结论:工艺更趋于合理,操作条件更为简单,三废易于处理,适合于工业化生产。

人肝癌5-脱氧-5-氟尿苷耐药细胞模型的建立及耐药机制探讨

目的建立耐药肝癌细胞模型BEL-7402/5-脱氧-5-氟尿苷(5'-DFUR)并研究其耐药特性。方法采用体外低浓度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立耐药人肝癌细胞模型BEL-7402/5'-DFUR细胞株。用MTT法检测该耐药细胞模型的多药耐药性,以流式细胞术检测该耐药模型细胞周期中的分布、细胞表面多药耐药基因(mdr1)的表达产物P-糖蛋白(P-gp)、bcl-2及谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)的表达等。结果(1)经MTT法检测BEL-7402/5'-DFUR细胞较亲本细胞的5'-DFUR半数抑制浓度(IC50)增大12.9倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。(2)耐药细胞S期细胞减少,G1、G2期细胞增多。(3)该耐药模型细胞表面mdr1的表达产物P-gp、Bcl-2非常显著升高,而GST-π表达无明显变化。结论BEL-7402/5'-DFUR细胞是一个明确的多药耐药模型,具有耐药细胞的基本生物学特性,同亲本细胞相比,其IC50提高12.9倍。细胞内药物蓄积明显降低,细胞周期分布发生变化,其多药耐药性与P-gp、bcl-2的高表达有密切关系。

酶法合成2＇－脱氧－5－氟尿苷

本文采用大肠杆菌核苷磷酸化酶，以５－氟尿嘧啶（ＦＵ）、２＇－脱氧尿苷（ｄＵ）和磷酸盐为底物酶法合成２＇－脱氧－５－氟尿苷，实验结果表明，含１０ｍｍｏｌ／ＬｄＵ、３０ｍｍｏｌ／ＬＦＵ、１０－３０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐的混合物加入５％培养２４ｈ的大肠杆菌湿菌体于ｐＨ７．０反应３ｈ，底物ｄＵ的转化率可达４５．９％。

利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究

利用产气肠杆菌EAM Z1转化合成5 氟尿苷,从筛选中间体稳定剂、底物流加、底物诱导、菌体冻融和石英砂研磨等方面研究转化率的影响因素,结果:(1)转化过程中加入40 mmol/L的硼砂可以将转化率达到75.56%,提高30.28%;加入10 mmol/L的甘氨酸可以使转化率达到61.92%,提高6.76%;(2)流加5 氟尿嘧啶可以将转化率提高到87.78%;(3)培养过程中加入尿苷诱导效果并不明显,尿苷浓度为 0.001 g/L时效果最佳,提高3.63%;(4)菌体冻融和石英砂研磨使转化率下降26%。

5-氟尿苷生物转化率的影响因素研究

目的:利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷(5-FUR),并对影响5-FUR转化率的因素进行了考察。方法:以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂的5-FUR的转化率为对照,考察反应溶剂Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、固定化细胞、粗酶液等因素对转化率的影响。结果:以Na2SO4溶液为溶剂进行转化,转化率可提高10%左右;双中间体稳定剂硼砂+硼酸使转化率提高20%左右;Mg2+和Zn2+可提高产物的转化率,在以PBS为溶剂的转化反应中,1 mmol/L Mg2使转化率提高了11.31%,以Na2SO4溶液为溶剂的转化反应中,4 mmol/L Zn2+使转化率提高了9.43%;以固定化细胞进行生物转化,反应时间缩短为1 h,但转化率略有降低;以粗酶液进行生物转化,反应时间为4 h,转化率提高21.29%。结论:5-FUR的转化率受多种因素的影响,合理的反应溶剂如Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、提取酶粗提液等方法均可以较显著的提高5-FUR的转化率。

脱氧氟尿苷在食管癌化疗中的高选择性抗肿瘤作用研究

目的:(1)了解脱氧氟尿苷(5-deoxy-5-fluorouridine,5-DFUR)在食管癌组织中转化为5-FU的情况及其高选择性抗肿瘤作用。方法:(1)选择拟行手术治疗的17例食管癌患者,术前5～7天口服5～DFUR1200mg/人/天后再行手术;(2)用柱切换反相高效液相色谱法检测食管癌组织、转移淋巴结、远癌正常食管组织及肝脏组织的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)浓度。结果:(1)在同一时点食管癌患者各组织的5-FU浓度分别是:癌组织214.18±92.53ng/g、转移淋巴结147.50±71.86ng/g、远癌食管组织50.67±20.24ng/g、肝脏组织17.80±9.09ng/g,P值<0.05。(2)不同分化程度的癌组织中5-FU浓度分别为:高分化鳞癌184.27±92.18ng/g、中分化鳞癌214.53±82.43ng/g、低分化鳞癌412.18±192.53ng/g,P值=0.024。(3)不同分期食管癌组织中的5-FU浓度为:Ⅱ期212.38±92.63ng/g,Ⅲ期247.50±91.99ng/g,P值=0.098。结论:5-DFUR能够高选择地在食管癌组织中转化为5-FU。不同分化程度的食管癌组织对5-DFUR的转化能力不同,分化能力愈低,转化为5-FU的能力愈强。

类巨噬细胞增强5'-脱氧氟尿苷抗结直肠癌细胞活性

目的探讨类巨噬细胞表达的胸苷磷酸化酶(dThdPase)能否增强细胞内激活抗癌药物5'-脱氧氟尿苷(5'-DFUR)抗结直肠癌细胞作用。方法应用ELISA法分别检测结直肠癌细胞系LS174T、CloneA、Colo320、CX-1、LOVO、MIP101和类巨噬细胞系THP-1、U937的dThdPase蛋白含量。采用MTT分析,分别测定出氟尿嘧啶(5-FU)和5'-DFUR在6株结直肠癌细胞的半数有效浓度(IC50)。把5-FU或5'-DFUR同THP-1或U937细胞一起培养24h,其上清液2倍稀释后加入结直肠癌细胞中行MTT分析,测定IC50有无改变。并在培养THP-1或U937的培养基中加入定量5'-DFUR后检测5-FU的生成量。结果6株结直肠癌细胞中仅LS174T检出0.5U/mg、LOVO检出8.9U/mg的dThdPase蛋白,其他4株未检出。而THP-1和U937的dThdPase蛋白含量则分别为18.2U/mg和19.3U/mg。5'-DFUR对全部癌细胞的IC50高于5-FU的14.5～94.4倍(P<0.01)。5-FU和5'-DFUR同THP-1(或U937)细胞一起培养24h后,5-FU对6种癌细胞的IC50无明显改变(P>0.05),而5'-DFUR的IC50则分别下降到原来的5.4%～41.8%(P<0.001)。并从加入400μmol5'-DFUR的THP-1和U937的培养液中分别检出40.2μmol和32.9μmol的5-FU。结论6株结直肠癌细胞基本无dThdPase活性,不能在细胞内转化5'-DFUR为5-FU。类巨噬细胞表达的dThdPase可以转化5'

单核细胞增强5′-脱氧氟尿苷抗结直肠癌细胞活性

目的 探讨巨噬细胞在结直肠癌化疗中的调控作用。方法 应用ELISA法分别检测结直肠癌细胞系LS174T、Clone A、Colo320、MIP101的胸苷磷酸化酶(dThdPase)蛋白含量。采用MTT分析,分别测定出氟尿嘧啶(5-FU)和5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)对上述4种癌细胞的半数有效浓度(IC50)。然后把5’-DFUR加入培养基中同人血单核细胞一起培养24 h,其培养上清液2倍稀释后加入结直肠癌细胞中行MTT分析测定其IC50有无改变。同时测定单核细胞在不同浓度5’-DFUR中的存活率。结果 4种结直肠癌细胞仅LS174T检出0.5 U/mg的dThdPase蛋白,其它3种未检出。4种癌细胞对5-DFUR的IC50均明显高于5-FU(P<0.01)。同人血单核细胞一起培养后,5’-DFUR对4种癌细胞的IC50明显下降,仅相当于处理前的11.6％～34.3％(P<0.05),同时发现5’-DFUR对人血单核细胞无明显生长抑制作用。结论 被检结直肠癌细胞因缺乏dThdPase活性,不能在细胞内转化抗癌药物5’-DFUR为5-FU发挥细胞毒作用;同人血单核细胞一起培养后,5’-DFUR在单核细胞内dThdPase的催化下,可转化成5-FU并释放到培养基中发挥抗癌作用。

5’-脱氧氟尿苷治疗BALB／C小鼠结肠癌实验模型

目的通过对BALB／C小鼠原位结肠癌实验模型应用5’-脱氧氟尿苷治疗，并同传统抗癌药物5-氟尿嘧啶进行比较，观察分析5’-脱氧氟尿苷在动物体内抗结肠癌细胞效应及在组织和血液中的转化。方法60只BALB／C小鼠采用盲肠原位瘤块接种法建立小鼠结肠癌CT26实验模型，术后第3天开始用随机数字表法把小鼠分成3组，每组20只。根据体重分别连续5d腹腔注射：（1）5’-脱氧氟尿苷组：5’-脱氧氟尿苷0．1mg／g；（2）5-FU组：5-FU0．02mg／g；（3）对照组：0．9％氯化钠溶液0．4mL。每组分别于术后第2、3周处死6只小鼠，测量肿瘤重量和体重变化，检测血常规和肝肾功能，并各保留8只小鼠等待自然死亡记录带瘤生存时间。另外把14只小鼠皮下接种CT26细胞约2周后，待注射局部形成皮下肿物，用随机数字表法分成2组，每组各7只，分别腹腔注射5’-脱氧氟尿苷0．1mg／g和5-氟尿嘧啶0．02mg／g，15min后同时处死取血和肿瘤组织测定转化后的5-氟尿嘧啶含量。结果5’-脱氧氟尿苷组小鼠肿瘤重量最小，术后2周和3周平均重量分别为（0．07±0．12）g和（0．24±0．29）g；平均带瘤生存期为（32．6±8．9）d。5-氟尿嘧啶组术后2周和3周平均肿瘤重量分别为（0．74±0．43）g和（1．13±0．75）g，平均带瘤生存期为（22．8±5．9）d。对照组术后2周和3周平均肿瘤重量分别为（0．70±0．47）g和（1．93±0．83）g，平均带瘤生存期为（17．5±2．8）d。5’-脱氧氟尿苷组小鼠肿瘤重量、带瘤生存期与5-氟尿嘧啶组及对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05）。各组小鼠在WBC、Hb、Plt、肝肾功能方面差异无统计学意义（P〉0．05），但5-氟尿嘧啶组在手术及应用药物后体重下降比较明显，与5’-脱氧氟尿苷组及对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．01）。5’-脱氧氟尿苷组小鼠在注药15min后肿瘤组织中检出5-氟尿嘧啶浓度为（54．71±12．82）μg/g，为同期血清中浓度的6．20倍（P〈0．05）。5-氟尿嘧啶组小鼠注药15min后，血清中检出5-氟尿嘧啶浓度为（133．35±20．69）μg／mL，为癌组织的1．55倍（P〈0．05）。结论5’-脱氧氟尿苷在BALB／c小鼠结肠癌模型中可以转化为5-氟尿嘧啶，并且癌组织中浓度高于血清浓度。5’-脱氧氟尿苷在小鼠体内抑瘤效果高于传统药物5-氟尿嘧啶，小鼠带瘤生存期长，全身不良反应轻微。

结直肠癌组织中胸苷磷酸化酶表达与5’-脱氧氟尿苷靶向治疗的关系

胸苷磷酸化酶(TP)是嘧啶和核苷代谢过程中的关键酶,近年发现其具有肿瘤血管新生作用,并与肿瘤病人的预后转归密切相关。同时TP还是5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR,商品名为氟铁龙)抑制肿瘤细胞生长的关键转化酶。目前,TP在结直肠癌细胞中是否表达尚无定论,但因其对肿瘤血管新生及增进5’-DFUR治疗效果的双重作用而倍受临床关注。文中对TP在结直肠癌组织中的表达与5’-DFUR细胞内激活、治疗的研究进展进行综述。