混合溶剂体系中牛肝β-半乳糖苷酶催化5-氟-2'-脱氧尿苷区域选择性半乳糖基化反应

研究了混合溶剂体系中有机溶剂种类和含量对牛肝β-半乳糖苷酶催化5-氟-2'-脱氧尿苷区域选择性半乳糖基化反应的影响.结果表明,在含10%(体积分数)有机溶剂体系中,该酶稳定性差,失活严重.减少有机溶剂含量可显著减轻其对该酶的毒害作用.然而,有机溶剂的添加对酶促糖基化反应的区域选择性的影响很小(均保持在99%以上).牛肝β-半乳糖苷酶在混合溶剂体系中的催化性能与有机溶剂的介电常数有良好的相关性,其中在含二甲亚砜(DMSO)体系中该酶催化活性最高.当体系中DMSO含量≤5%时,目标产物收率达71%.

5-氮杂-2'-脱氧胞苷与5-氟尿嘧啶的协同抗胃癌作用

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-Deoxycytidine,5-Aza-CdR)对胃癌细胞的作用,并进一步明确他与传统化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fu)之间的相互关系.方法:选取野生型P53的胃癌AGS和突变型P53的BGC-823细胞用2.5mol/L5-Aza-CdR分别处理0-96h,MTT检测5-Aza-CdR处理前后细胞活力的变化.为了进一步探讨5-Aza-CdR的抗胃癌作用机制,我们用AnnexinⅤ检测细胞早期凋亡、caspases活性检测凋亡诱导通路及Westernblot检测下游相关蛋白的表达.结果:与未用5-Aza-CdR处理的空白对照组细胞相比,5-Aza-CdR时间依赖性地抑制了胃癌AGS和BGC-823细胞的生长活性(P<0.01).在探讨其作用机制时我们发现,5-Aza-CdR的抗胃癌毒性作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的.但细胞的不同P53状态可触发不同的细胞凋亡路径:在野生型AGS细胞中,5-Aza-CdR的凋亡机制是通过内源性的凋亡通路(caspase9)所介导的;但在BGC-823细胞中,5-Aza-CdR的促凋亡效应是独立于caspase凋亡路径的,因为我们并未观察到5-Aza-CdR处理后细胞caspases活性及蛋白表达水平的增加.尤为有意义的是,当5-Aza-CdR与5-Fu联合应用后,他显著增加了AGS和BGC-823细胞对5-Fu的敏感性.结论:以上数据明显证明5-Aza-CdR可作为一种卓有成效的抗胃癌药,特别是他与传统化疗药的协同抗癌效应,将对5-Aza-CdR未来在临床上的应用提供实践指导意义.

联苯吡菌胺关键中间体3′,4′-二氯-5-氟-1,1′-联苯-2-胺的合成

为获得联苯吡菌胺关键中间体3′,4′-二氯-5-氟-1,1′-联苯-2-胺的适合工业化生产工艺路线,对其合成工艺进行了优化。以3,4-二氯溴苯和2-溴-4-氟苯胺为原料,经格氏和Suzuki偶联2步反应合成了3′,4′-二氯-5-氟-1,1′-联苯-2-胺,其结构经1H NMR、MS表征确证,并对合成条件进行了优化。优化条件下,3′,4′-二氯-5-氟-1,1′-联苯2-胺合成总收率61.9%,纯度98%。该工艺成本低,收率高,具有工业化生产前景。

Pd-有机膦催化Suzuki偶联合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯

以3,4-二氯苯硼酸和2-溴-4-氟苯胺为原料,在碱性条件下使用Pd-有机膦复合催化剂进行Suzuki偶联反应,经分液、减压浓缩得到2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯。通过对不同反应条件进行优化,获得优化条件为:以甲苯和水为混合溶剂,n(2-溴-4-氟苯胺)∶n(3,4-二氯苯硼酸)∶n(K_(2)CO_(3))∶n(复合催化剂)=1∶1.2∶1.2∶0.0005,反应温度85℃,反应时间4h,产物纯度98.0%,收率大于97.0%。该方法催化剂用量少、工艺简单、产品收率高,符合绿色化学生产理念,具有工业化前景。

基于微通道技术合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯

2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯是琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂—联苯吡菌胺的重要中间体。基于微通道技术,以3,4-二氯苯胺为原料,经重氮化、中和、与对氟苯胺偶联得到2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯。系统考察了影响重氮化、中和、偶联3步对反应的影响,并得出优化条件:盐酸与3,4-二氯苯胺当量6:1,亚硝酸钠与3,4-二氯苯胺当量1.1︰1,成盐反应温度60℃,重氮反应温度25℃,氢氧化钠当量6.5︰1,中和温度25℃,偶联最佳温度120℃,对氟苯胺当量10︰1。在此优化条件下合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯粗品含量85%,精制后含量可以达到98.5%,2步总收率65%。

2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺改进

目的:改进2'-脱氧-5-氟尿苷的合成工艺。方法:参照文献方法,以氟尿嘧啶为起始原料,经硅醚化、缩合、溴化、氢化和皂化等工艺合成2'-脱氧-5-氟尿苷,并对其关键步骤进行了改进。结果:该合成工艺对2'-脱氧-5-氟尿苷有较高的收率,总收率为34.31%。结论:工艺更趋于合理,操作条件更为简单,三废易于处理,适合于工业化生产。

HPLC法同时测定人血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的浓度

目的:建立一种同时测定人体血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷浓度的HPLC法。方法:以肌苷为内标,血浆样品用硝酸银(10%)沉淀蛋白质,采用C_(18)柱,检测波长为266nm,流动相:0.01mol·L^(-1)磷酸盐(用2mol·L^(-1)氢氧化钠溶液调pH为7.0)-甲醇(96∶4),流速1.0mL·min^(-1),柱温为45℃。结果:5-氟尿嘧啶和5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷分别在0.1～20μg·mL^(-1)(r=0.9997)和0.2～40μg·mL^(-1)(r=0.9997)浓度范围内线性关系良好,最低检测浓度分别为5和10ng·mL^(-1),方法回收率分别为98.2%～101.2%、99.5%～102.3%,日内、日间RSD均小于6%。结论:方法灵敏、快速、准确,适用于临床上测定5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的血药浓度及药动学的研究。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷调控HOXA10对子宫内膜异位症患者在位内膜容受性的影响

目的:研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,AZA)对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜容受性的影响。方法:体外原代培养内异症子宫内膜上皮细胞,AZA作用24h后,亚硫酸氢盐测序法(BisulfiteSequencing)检测HOXA10的甲基化水平的变化;实时定量PCR和Western Blot方法检测HOXA的转录和蛋白水平的变化。结果:AZA作用24h后,子宫内膜上皮细胞HOXA10的甲基化水平下降;同时HOXA10的表达增加。结论:AZA可通过抑制内异症子宫内膜上皮细胞中HOXA10的高甲基化,上调HOXA10的表达,从而促进子宫内膜容受性的建立。

5,5'-(2-三氟甲基)-咪唑-4,5-二(1H-四唑)及其含能离子盐的合成与表征

以二氨基马来腈为原料,经过与三氟乙酸酐缩合、环化,与叠氮化纳再次缩合,合成得到了新型含能化合物5,5'-(2-三氟甲基)-咪唑-4,5-二(1H-四唑),收率61.3%;基于该化合物的酸性,设计合成了2种含能离子盐5,5'-(2-三氟甲基)-咪唑-4,5-二(1H-四唑)的羟胺盐和胍盐。利用红外光谱、核磁共振和元素分析对中间体及产物结构进行了表征。探讨了生成5,5'-(2-三氟甲基)-咪唑-4,5-二(1H-四唑)过程中影响四唑环化反应的关键因素,确定的最佳反应条件为:反应介质为水,n(2-三氟甲基-4,5-二氰基咪唑)∶n(Na N3)=1∶2.4,反应温度98℃,反应时间4 h。收率最高达86.3%。通过DSC-TG研究了5,5'-(2-三氟甲基)-咪唑-4,5-二(1H-四唑)的热分解性能,热分解曲线表明化合物直到223.65℃才开始分解,整个分解过程经历了两个主要的放热分解阶段和热失重阶段,最大放热峰温度为285.78℃,说明该化合物结构比较稳定。

5(6)-羧基荧光素标记2′-脱氧尿苷的合成

以5-碘-2'-脱氧尿嘧啶为起始原料,5(6)-羧基荧光素为荧光标记物,经6步反应合成了5(6)-羧基荧光素标记的2′-脱氧尿苷,并利用高效液相色谱(HPLC),1HNMR和13CNMR对目标化合物的纯度和结构进行了表征.

5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导裸鼠HepG2种植瘤细胞T-cadherin的表达及其对种植瘤的抑制作用

目的:探讨去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)在裸鼠体内诱导HepG2细胞T-cadherin的表达,及其对HepG2种植瘤生长的抑制作用.方法:皮下接种法建立HepG2细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(11只)和对照组(10只).实验组裸鼠给予5-Aza-CdR注射,对照组裸鼠注射等量PBS.4wk后处死裸鼠,观察种植瘤的生长情况,用RT-PCR技术及免疫组织化学技术检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达.结果:用药4wk后,实验组肿瘤组织的T-cadherin mRNA的表达水平显著高于对照组(t=6.613,P<0.05);对照组HepG2细胞几乎检测不到T-cadherin蛋白表达,而实验组裸鼠种植瘤细胞膜上可检测到T-cadherin蛋白表达;实验组肿瘤的平均体积明显小于对照组肿瘤平均体积(t=2.337,P=0.025).结论:5-Aza-CdR能诱导裸鼠皮下种植HepG2瘤细胞的T-cadherin表达,抑制HepG2种植瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的T-cadherin启动子去甲基化,恢复T-cadherin的表达,从而抑制HepG2种植瘤生长.

5-氮-2'-脱氧胞苷对非霍奇金淋巴瘤p73基因甲基化的逆转作用

目的探讨5-氮-2'-脱氧胞苷对非霍奇金淋巴瘤(NHL)p73基因甲基化的逆转作用。方法用甲基化特异性PCR(MSP)方法对24例NHL p73基因启动子的甲基化进行检测,用5-氮-2'-脱氧胞苷处理部分NHL原代培养细胞后,检测p73 mRNA表达情况。结果 24例NHL中21例发生甲基化,甲基化阳性率高达87.5%;对照组(12例反应性增生淋巴结细胞及22例正常人外周血淋巴细胞)均未出现甲基化。部分未经治疗的NHL样本经5-氮-2'-脱氧胞苷处理后,p73 mRNA表达恢复。结论 p73基因启动子的甲基化可被5-氮-2'-脱氧胞苷逆转,导致因甲基化而被抑制的p73基因表达上调。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.方法:使用1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化,且EDNRB mRNA不表达,经1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR处理4d后,EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转,细胞中EDNRB mRNA表达恢复.4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;并抑制SGC-7901细胞生长周期,其细胞周期阻滞于S期,5、10μmol/L5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且差异有统计学意义(7.13%±0.87%,13.34%±1.12% vs 3.69%±0.52%,P=0.032,P<0.001).结论:5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制该细胞的生长.

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对食管鳞癌ECa109细胞增殖及TIG1基因表达与甲基化状态的影响

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxy-cytidine,5-aza-CdR)对食管鳞癌细胞株ECa109增殖抑制作用,以及对ECa109中TIG1基因甲基化状态及其mRNA表达的影响。方法:实验组分别使用10、20、50、100μmol/L的5-aza-CdR处理ECa109细胞,对照组用不添加5-aza-CdR培养基培养;采用MTT法检测两组细胞生存率的变化;MSP检测TIG1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测TIG1基因mRNA表达水平。结果:5-aza-CdR可以显著抑制ECa109的生长,实验组细胞生存率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组同种药物浓度,作用时间延长,生存率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);同一作用时间,随着药物浓度增加,细胞生存率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组ECa109细胞TIG1基因处于高甲基化状态,经过10μmol/L及20μmol/L的5-aza-CdR处理细胞株120h后,TIG1基因的甲基化部分解除。对照组ECa109细胞中无TIG1 mRNA表达,采用10μmol/L及20μmol/L浓度药物处理72、120、168h后细胞株中TIG1 mRNA恢复表达,且20μmol/L处理组细胞较10μmol/L组TIG1 mRNA表达增强。结论:5-aza-CdR可以抑制ECa109细胞生长,且具有剂量及时间依赖性;ECa109中TIG1基因甲基化阳性,其mRNA的表达缺失;经5-aza-CdR干预后可使TIG1基因发生去甲基化修饰,恢复表达,去甲基化修饰具有时间及剂量依赖效应。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响

目的研究5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响及其机制。方法用浓度为50μmol/L的5-Aza-CdR处理HepG2细胞72 h后,流式细胞仪分析HepG2细胞周期的分布和凋亡的情况;transwell实验检测细胞侵袭能力;RT-PCR检测肝癌中失活的抑癌基因SIAH1 mRNA表达量的变化。并与未经任何药物处理的正常HepG2细胞相比。结果与正常HepG2细胞相比,5-Aza-CdR处理后的HepG2细胞周期阻滞于S期(P<0.05),细胞早期凋亡率增加(P<0.05),且细胞体外侵袭力减弱(P<0.05),SIAH1基因的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR可能通过上调SIAH1的表达,调控细胞周期并诱导细胞凋亡,同时抑制HepG2细胞体外侵袭能力。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2中抑癌基因MIA2表达的影响

目的应用甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作用肝癌细胞株HepG2,观察其对细胞增殖和凋亡的影响,并观察用药后肝癌细胞中黑色素瘤抑制蛋白2(melanoma inhibitory activity 2,MIA2)表达的变化情况。方法分别以浓度0、1、2、4、8、10、20、40μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。再以0μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,细胞免疫组化和Western blot检测细胞中MIA2蛋白表达。结果 5-Aza-CdR作用HepG2后,MTT结果显示细胞增殖受到抑制,在一定药物浓度范围内,细胞增殖抑制率和药物浓度呈正相关;流式细胞术结果显示细胞早期凋亡增加,在一定药物浓度范围内,早期凋亡率和药物浓度呈正相关;细胞免疫组化和Western blot结果显示与对照组(0μmol/L)比较,10μmol/L组中MIA2蛋白表达增强。结论 5-Aza-CdR作用HepG2细胞后,MIA2蛋白表达明显增强,细胞增殖受到抑制,早期凋亡增加。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合多西紫杉醇对前列腺癌细胞系PC3恶性表型抑制作用的实验研究

目的:观察甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dc)联合多西紫杉醇(DT)对人前列腺癌(PCa)细胞系PC3细胞增殖、迁移、侵袭能力、细胞周期变化和细胞凋亡的影响,探讨上述两种药物联合应用对前列腺癌细胞的体外抗肿瘤效应。方法:实验分为对照组、5-aza-2dc组、DT组及5-aza-2dc和DT联合用药组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、划痕损伤实验、细胞迁移实验分别观察5-aza-2dc和(或)DT对PC3细胞株增殖、迁移、侵袭能力的抑制效应,利用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其与细胞周期的关系。结果:5-aza-2dc组、DT组及联合用药组均能明显提高对PC3细胞的抑制率,降低细胞迁移距离,减少侵入下室的细胞(P<0.05),联合用药组作用更明显;对照组、5-aza-2dc组、DT组及联合用药组细胞凋亡率分别为(10.65±0.39)%、(16.60±0.67)%、(17.95±1.08)%、(22.98±1.18)%,各用药组均能明显提高细胞凋亡率,联合用药组作用更明显(P<0.05);联合用药组能明显减少G0/G1期细胞,增加G2/M期细胞(P<0.05)。结论:5-aza-2dc和DT单独及联合应用均能在体外细胞水平显著抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭作用,诱导细胞凋亡,使细胞停滞于G2/M期,两药联合的作用比各单药作用大,5-aza-2dc和DT联合作用于PC3细胞具有协同作用,值得进一步研究。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞RAR-β基因去甲基化及其表达的作用

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肺腺癌SPC-A-1细胞视黄酸受体β(RAR-β)基因甲基化状态的影响,探讨不同浓度5-Aza-CdR对RAR-β基因表达缺陷的调控机制。方法将体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株分为4组,分别是A组(未加药)及B、C、D组(分别加入3、6、12μmol/L的5-Aza-CdR)。采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测4组细胞RAR-β基因甲基化状态的差异,RT-PCR法检测4组细胞RAR-βmRNA表达水平的差异,Western blot检测4组细胞RAR-β蛋白表达水平的差异,流式细胞仪技术检测各组细胞周期及细胞凋亡率的差异。结果 A组标本检测出RAR-β基因为甲基化状态,而B、C、D组均检测出RAR-β为去甲基化状态。肺腺癌SPC-A-1细胞RAR-βmRNA及RAR-β蛋白表达水平低下,经5-Aza-CdR处理后,其表达水平明显增强(P<0.01)。5-Aza-CdR处理后(B、C、D组)的细胞凋亡率均较A组明显提高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论肺癌RAR-β基因因甲基化出现表达缺陷,5-Aza-CdR具有明显去甲基化作用,可诱导RAR-β基因重新激活表达,促进肺癌细胞凋亡及抑制癌细胞增殖,从而发挥抗癌作用。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法分别用低、中、高浓度5-Aza-CdR处理AGS,对照组不处理。CCK-8检测AGS细胞增殖状态,流式细胞仪检测AGS细胞周期及凋亡率,MSP检测AGS中DAPK基因启动子甲基化状态,RT-PCR和Western blot法分别检测AGS中的DAPKmRNA及其蛋白。结果低、中、高浓度组AGS细胞增殖速度显著低于对照组(P均<0.05),并呈浓度、时间依赖性(P均<0.05)。5-Aza-CdR使AGS细胞停滞在G0/G1期(P均<0.05),细胞凋亡率增加(P均<0.05)。对照组DAPK基因启动子表现甲基化状态,低、中、高浓度组DAPK基因启动子被逆转成未甲基化状态。低、中、高浓度组AGS细胞DAPK mRNA及蛋白表达量均显著高于对照组(P均<0.05),并呈浓度依赖性。结论 5-Aza-CdR可抑制AGS细胞增殖、促进其凋亡,可能与逆转DAPK基因启动子甲基化状态并使其重新表达有关。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胰腺癌细胞株Capan-2增殖及其PCDH8基因表达的影响

目的探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株增殖的影响以及对其原钙黏附素(protocadherin 8,PCDH8)基因表达的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理胰腺癌Capan-2细胞。阴性对照组不加药,根据5-Aza-CdR处理的剂量分为:0.08μmol/L组、0.40μmol/L组、2.00μmol/L组、10μmol/L组、50μmol/L组,检测细胞的生长情况;采用RT-PCR和Western Blot检测各组胰腺癌细胞PCDH8基因和蛋白的表达。结果5-Aza-CdR对胰腺癌细胞具有明显的抑制作用,且随着浓度的增加,抑制率逐渐增强(P<0.01);但是随着时间的增加,抑制率逐渐下降(P<0.01)。5-Aza-CdR和吉西他滨联用对胰腺癌细胞的抑制作用和诱导凋亡作用最强(P<0.05,P<0.01)。5-Aza-CdR能显著增加胰腺癌细胞PCDH8基因和PCDH8蛋白的表达水平,且随着浓度的升高,增加作用越明显(P<0.01)。结论5-Aza-CdR能够抑制胰腺癌细胞的增殖,增加PCDH8基因的表达,与吉西他滨联合后抑制作用更强。