5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷对HL-60细胞周期的影响及作用机制

目的:研究5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷(AICAR)对人白血病HL-60细胞周期的影响及作用机制。方法:培养HL-60细胞,以CCK-8法行细胞增殖抑制实验,计算加入不同浓度AICAR(1 000μM、500μM、250μM、125μM)、不同时间点(24 h、48 h、72 h)对HL-60细胞增殖的抑制率,寻找最佳浓度和时间点,然后以流式细胞技术分析细胞周期,再以逆转录-PCR(RT-PCR)方法对细胞周期调控因子p21、p27、CDK2的表达进行半定量定性分析。结果:CCK-8实验显示AICAR浓度越大,HL-60细胞的增殖抑制率越高。流式细胞周期分析发现加入AICAR后细胞发生了S期停滞。RT-PCR结果显示,与对照组比较,加入AICAR后加药组HL-60细胞CDK-2的表达无明显变化,而p21、p27的表达明显增强。结论:AICAR可以通过上调细胞周期调控因子p21、p27的表达影响细胞周期,抑制HL-60细胞的增殖。

5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸联合干扰素对K562细胞的影响

目的:研究5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)联合干扰素(IFN-ɑ-2b)对慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;Wright-Giemsa方法染色,光学显微镜下观察细胞形态;FITC AnnexinV/PI双染法分析细胞凋亡率的变化;免疫细胞化学法检测野生型P53蛋白的阳性表达率。结果:不同浓度AICAR于不同作用时间24、48和72 h对K562细胞均有抑制作用,抑制程度呈时间、剂量依赖性(r=0.71,r=0.84)。AICAR与IFN-ɑ-2b联合应用后可以有效抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡,联合作用72 h时细胞的抑制率可达(45.26±2.54)%,联合作用48 h早期凋亡率达(33.72±0.23)%,与对照组及单用AICAR和单用IFN-ɑ-2b相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。AICAR与IFN-ɑ-2b联合作用促进野生型P53蛋白的表达。结论:AICAR和(或)IFN-ɑ-2b能抑制细胞增殖,促进K562细胞凋亡,2药联合具有协同抗瘤效应,其作用机制可能与促进野生型P53蛋白高表达有关。

5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对人胃癌BGC823细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的研究5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide,AICAR)对人胃癌BGC823细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法分别将0.5、1、2和3mmol·L^(-1) AICAR作用于人胃癌BGC823细胞24、48和72h后,应用MTT法检测细胞增殖情况;Western blot法检测BGC823细胞内磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated-Adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)蛋白的表达。2mmol·L^(-1) AICAR作用24h后,应用划痕愈合实验、Transwell小室法分别检测细胞的迁移和侵袭能力;结果 MTT法检测结果显示,0.5、1、2和3mmol·L^(-1) AICAR分别作用24、48和72h后,人胃癌BGC823细胞的增殖能力均被抑制,随着AICAR作用浓度增加和作用时间的延长,对BGC823细胞抑制作用逐渐增强,呈时间和剂量依赖性(P均<0.01);与对照组相比,2mmol·L^(-1) AICAR作用后,BGC823细胞的迁移和侵袭能力均减弱(P均<0.01);随着AICAR作用浓度增加和作用时间延长,p-AMPK蛋白表达逐渐增加(P均<0.01)。结论 AICAR可抑制BGC823细胞的增殖、迁移和侵袭能力;AICAR通过上调BGC823细胞内p-AMPK蛋白表达而发挥肿瘤抑制作用。

5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷对大鼠子宫平滑肌收缩功能的影响

目的研究5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷(AICAR)对子宫平滑肌的收缩特性的影响。方法分离孕SD大鼠和未孕SD大鼠的子宫平滑肌,制备子宫肌条,采用累积给药法加入5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷或双丁酸环腺苷酸(dibutyryl-cAMP,dbcAMP)(浓度从10-9到10-4mol.L-1),或采用5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷或双丁酸环腺苷酸预孵(浓度10-5mol.L-1)未孕大鼠子宫平滑肌,然后采用乙酰胆碱及缩宫素诱导子宫平滑肌收缩,利用RM6240-BD生物信号采集系统记录子宫平滑肌收缩幅度的变化。结果 5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷或双丁酸环腺苷酸对孕鼠和未孕鼠的子宫平滑肌收缩幅度均呈浓度依赖性抑制。对孕大鼠子宫平滑肌,在浴槽浓度达10-7mol.L-1时,能产生显著抑制作用(P<0.01),-log(IC50)分别为7和7.5。对未孕大鼠子宫平滑肌,5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷和双丁酸环腺苷酸对乙酰胆碱及缩宫素诱导的子宫平滑肌收缩均有明显抑制作用。结论 5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷对孕鼠及未孕鼠子宫平滑肌的收缩均有明显抑制作用,提示其具有松弛子宫平滑肌作用。

5-氨基咪唑-4甲酰胺核苷酸对飚62细胞增殖、分化及凋亡的影响

目的 探讨单磷酸腺苷激酶(a monophosphate kinase,AMPK)激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminimidazole-4-formamide nucleotide,AICAR)对慢性粒细胞白血病K562细胞株增殖、分化、凋亡的影响.方法CCK-8法检测K562细胞增殖;Wright-Giemsa染色及光学显微镜下观察K562细胞形态;流式细胞仪检测K562细胞表面CD7、CD11b、CD34、HLA-DR表达;FITC Annexin-V/PI双染检测K562细胞早期凋亡;免疫细胞化学法检测野生型P53蛋白表达情况.结果 不同浓度(1.0~2.0 mmol/L)AICAR及不同作用时间(24-72 h)对K562细胞增殖均有抑制作用,并呈时间、剂量依赖性.AICAR可促进野生型p53蛋白的表达.2.0 mmol/LAICAR处理的K562细胞与对照组相比CD7、CD11b、CD34、HLA-DR表面抗原表达无显著差异(P>0.05).结论AICAR对K562细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性,其作用机制可能与上调野生型P53蛋白有关.

AICAR通过激活Foxc1信号抑制小鼠F9细胞增殖

为了探索5-氨基咪唑-4-氨甲酰核糖核苷(AICAR)抑制小鼠F9细胞(F9 embryonal carcinoma cells)增殖的作用机制,本文构建了Foxc1的慢病毒真核表达载体,通过实时定量PCR、免疫荧光染色、双荧光素酶报告基因检测系统以及细胞增殖检测试验,探索AICAR抑制小鼠F9细胞的增殖作用机制.结果发现,AICAR可以在RNA和蛋白水平促进Foxc1的基因表达,并可以作用于核转录因子κB通路.另外在培养液中添加AICAR或过表达Foxc1都能抑制F9细胞的增殖.信号通路报告载体检测发现Foxc1可以激活核转录因子κB通路以及细胞周期相关的通路.总之,本研究证明,AICAR通过激活Foxc1通路及其下游多条信号通路来抑制F9细胞增殖.

力竭运动对小鼠骨骼肌细胞自噬的影响及相关调节机制研究

目的:研究力竭运动对C57BL/6小鼠骨骼肌细胞自噬的影响,并探讨AMPK在骨骼肌自噬中的作用和调节机制。方法:8周龄C57BL/6小鼠96只,随机分为AICAR注射组,力竭运动组,Compound C注射+力竭运动组及相应对照组。各组小鼠分别在AICAR注射后1h,2h和6h或在进行终强度为11m/min的力竭跑台运动后即刻,3h,6h,12h,24h取材,每组6只。通过ELISA法测定AMPK酶活性,采用Western Blot法测定p-ULK1,ATG 7,LC3,Beclin1和p62蛋白表达,免疫共沉淀法测定AMPK/ULK1结合量。结果:AICAR注射后1h时AMPK酶活性、p-ULK1、AMPK/ULK1结合量、LC3-I和LC3-II显著升高(P<0.05),LC3-II/LC3-I比值显著增大(P<0.01),ATG 7、Beclin1显著下降(P<0.05),p62变化不明显,2h时除LC3-II显著下降外(P<0.01),其余指标基本恢复;力竭运动组AMPK酶活性,p-ULK1、AMPK/ULK1结合量,LC3-I和LC3-II运动结束即刻增加非常显著(P<0.01),LC3-II/LC3-I比值显著增大(P<0.01),恢复期(3h、6h、12h、24h)显著下降(P<0.01),ATG 7、Beclin1和p62运动后即刻显著下降(P<0.05),恢复期ATG 7始终低于对照组,Beclin1和p62逐渐恢复;Compound C注射+力竭运动组AMPK活性,p-ULK1含量和AMPK/ULK1结合量基本不变,LC3-I,LC3-II和LC3-II/LC3-I比值在运动后变化同力竭组一致,但显著低于力竭组(P<0.05),ATG 7,Beclin1变化同力竭组,但显著高于力竭组(P<0.05),p62在运动后即刻显著升高,恢复期(3h、6h、12h、24h)显著下降(P<0.05)。结论:AMPK是骨骼肌内细胞自噬的重要调节因子,力竭运动可以通过AMPK/ULK1途径显著提高骨骼肌细胞自噬水平,但AMPK/ULK1并非是调节骨骼肌细胞自噬的唯一途径。

AMPK活性对宰后牛肉糖酵解、肌肉内环境及品质的影响

为探究牛肉宰后成熟过程中单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase,AMPK)对糖酵解、肌肉内环境及品质的影响,以0.50 mol/L 5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷(5-amino-4-imidazolecarboxamide,AICAR)处理的西杂牛背最长肌为对象,于4℃进行成熟,测定宰后成熟期间肌肉AMPKα基因(PRKAA1、PRKAA2)转录量、P-AMPK表达量、AMPK活性、糖酵解水平及品质指标的变化情况。结果表明:宰后24~120 h,处理组AMPKα基因转录量、P-AMPK表达量及AMPK活力均显著高于对照组(P<0.05);72~168 h,处理组pH值和肌糖原含量显著低于对照组(P<0.05),乳酸含量显著高于对照组(P<0.05);12~168 h,处理组L*、b*值及ATP、ADP、AMP和IMP含量均显著高于对照组(P<0.05),a*值显著低于对照组(P<0.05);24~120 h,处理组蒸煮损失率和肌原纤维小片化指数显著高于对照组(P<0.05),剪切力显著低于对照组(P<0.05)。AICAR通过激活AMPK并加快宰后糖酵解影响肌肉内环境、肉色、剪切力及肌纤维微观结构变化,加快宰后肌肉成熟进程,说明AMPK活性对宰后肌肉糖酵解及品质变化具有重要影响,且可通过调控宰后肌肉AMPK活性来调节肌肉品质。

ATIC在结直肠癌中的临床价值及对其细胞生物学功能的影响

目的 探讨5-氨基咪唑-4-羟酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(ATIC)在结直肠癌中的临床价值及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响。方法 利用GEO、TCGA、GTEx数据库和结直肠癌患者肿瘤组织标本,对结直肠癌中ATIC的表达情况及其与患者临床病理特征的关系进行分析;利用TIMER生物数据库对结直肠癌组织中ATIC的mRNA表达水平与肿瘤组织中免疫细胞浸润情况进行分析;联合TCGA和GTEx生物数据库评估ATIC在结直肠癌患者中的预后判断价值。建立稳定敲低ATIC表达的结直肠癌细胞系sh-ATIC-SW480,通过CCK-8实验和克隆形成实验检测ATIC对结直肠癌细胞增殖能力的影响,通过Transwell实验和划痕实验分析ATIC对结直肠癌细胞迁移能力的影响。结果 ATIC在结直肠癌组织中的表达水平明显高于正常结直肠组织;在结直肠癌中,ATIC的mRNA表达水平与肿瘤的TNM分期(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)密切相关;结肠癌患者的无病生存期与ATIC的表达显著相关;敲低ATIC表达后,结直肠癌SW480细胞的增殖和迁移能力受到抑制。结论 ATIC在结直肠癌组织和细胞中高表达,具有影响结直肠癌细胞增殖和迁移的作用,其表达水平与结直肠癌患者临床病理特征相关,并对结肠癌具有评估预后的价值。

大气PM2.5加重2型糖尿病模型小鼠肝损伤与AMPK抑制的相关性

[背景]有研究发现大气细颗粒物(PM2.5)暴露会导致肝纤维化和非酒精性脂肪肝。2型糖尿病(T2DM)患者本身因出现胰岛素抵抗、脂质堆积及炎症而致肝脏损伤严重。大气PM2.5暴露是否会加重T2DM患者肝损伤目前还不清楚,对该机制的研究较少。[目的]探索腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在大气PM2.5所致T2DM小鼠肝脏损伤中的作用。[方法]将32只6周龄的db/db小鼠随机分为4组:洁净空气暴露组(FA组)、洁净空气暴露+5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)干预组(FA-AIC组)、浓缩PM2.5暴露组(PM组)和浓缩PM2.5暴露+AICAR干预组(PM-AIC组)。小鼠在气象-环境动物暴露系统中每天暴露10 h,共12周,FA-AIC和PM-AIC组在第11周开始每天腹腔注射AICAR(250 mg/kg),共2周。采用苏木精-伊红(HE)染色法检测肝脏病理变化;采用实时荧光定量PCR法测定肝脏组织中AMPK、白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA表达水平;通过Westernblot法检测AMPK、P-AMPK、沉默信息调节因子2同源酶1(SIRT1)、P38-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、P-P38-MAPK、蛋白激酶B(AKT)、P-AKT蛋白表达水平。[结果] PM组肝脏脂肪变性分数、肿大分数、小叶和门管区炎症分数分别为1.50±0.42、1.10±0.35、0.80±0.12、0.70±0.16;PM-AIC组肝脏脂肪变性分数、肿大分数、小叶和门管区炎症分数分别为1.40±0.31、1.20±0.29、0.70±0.22、0.60±0.18,均大于相应的FA组(P < 0.05);FA-AIC组肝脏肿大分数和肝小叶炎症分数均小于FA组(P < 0.05);PM-AIC组和PM组肝脏脂肪变性分数、肿胀分数、小叶和门管区炎症分数的差异不具有统计学意义。结果显示,PM2.5抑制了肝脏AMPK mRNA的表达,促进了IL-6和TNF-α mRNA的表达。无论是暴露于浓缩PM2.5还是清洁空气,注射AICAR后均能增加AMPK的mRNA表达(P < 0.05)。此外,暴露于浓缩PM2.5的小鼠肝脏SIRT1蛋白表达水平以及AMPK和AKT的磷酸化水平与暴露于清洁空气的小鼠相比,差异均具有统计学意义(P < 0.05)。在注射了AICAR后,暴露于洁净空气的小鼠肝脏AMPK和AKT的磷酸化水平增加(P < 0.05),但暴露于浓缩PM2.5的小鼠在注射AICAR后,肝脏内这些蛋白表达水平变化均无统计学意义(P > 0.05)。[结论]大气PM2.5加重2型糖尿病模型小鼠肝损伤与AMPK抑制相关。

AMPK在胰岛素信号转导通路中的作用

单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated potein kinase,AMPK)作为一种细胞能量调节器,当细胞经历代谢应激反应时,伴随着细胞内AMP水平或AMP与ATP的比例升高,AMPK被AMP激活,其活化的结果导致脂肪酸氧化的增加以产生更多ATP;同时,抑制ATP消耗,综合效应是帮助细胞度过急性损伤,暂时保障细胞的存活。因为一些治疗2型糖尿病的药物通过激活AMPK而发挥作用,故AMPK被认为是各种潜在的和有效的抗糖尿病药物的靶效应器。5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside,AICAR),进入细胞后被磷酸化变成ZMP,后者类似AMP也能够激活AMPK。因此,我们采用AICAR激活AMPK,观察活化的AMPK对脂肪细胞能量代谢及胰岛素信号途径的作用。结果显示,脂肪细胞中的AMPK被激活后,丙酰辅酶A(malonyl-CoA,一种脂肪酸氧化作用的抑制剂及脂肪酸合成的前体中间产物)浓度下降80%;在已分化的3T3-F442a脂肪细胞中,AICAR通过激活AMPK,增强胰岛素对Akt/PKB的激活和GSK3的磷酸化。相反,在AICAR预处理的细胞中,胰岛素对mTOR的激活能力被降低;同时,mTOR下游效应器(如p70S6K、S6及4E-BP1)的磷酸化也降低。结果还显示,AMPK可在体外直接磷酸化mTOR,并抑制其自身的磷酸化活性。与此相应,2-双脱氧葡萄糖诱导的AMPK活化可导致TSC2缺乏的MEF细胞中mTOR的抑制。以上研究结果表明,AMPK在多个方面调节mTOR,并首次揭示AMPK直接磷酸化mTOR,导致其酶活性的改变。总之,AMPK全面参与了调节脂肪细胞的能量代谢:抑制脂肪酸及蛋白质的合成、刺激脂肪酸的氧化作用。