5-氮杂胞嘧啶的合成研究

以腈基胍和无水甲酸为原料 ,不使用任何溶剂 ,在 118～ 12 0℃下直接生成脒基脲甲酸盐 ,用乙醇洗涤纯化 ,干燥后在烘箱中 14 5℃下进行固态无溶剂反应 ,脱水生成 5 氮杂胞嘧啶 .用水重结晶 ,产品纯度达到 98.5 %以上 ,总产率为 6 0 .0 % .该产品通过IR ,1HNMR ,13 CNMR检测 ,证实为 5

5-氮杂胞嘧啶诱导人骨髓基质干细胞心肌分化

目的 :研究 5 -氮杂胞嘧啶 (5 -aza)诱导人骨髓基质干细胞 (hMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌特异基因的表达变化。方法 :取传至第 8代hMSC ,以 3μmol/L的 5 -aza孵育细胞 2 4h ,分别在诱导后 3d、1周、2周和 3周 4个时间点提取细胞RNA ,以RT -PCR方法检测细胞心肌特异转录因子Nkx2 .5和心肌特异基因 (connexin4 3、ANP等 )的表达。结果 :hMSC经 5 -aza诱导后 ,形成肌节样结构。RT -PCR的结果显示 ,5 -aza可诱导心肌特异基因connexin4 3和ANP的表达 ,随诱导时间延长 ,connexin4 3和ANP的表达量逐渐增加。 5 -aza还能诱导hMSC表达心肌特异转录因子Nkx2 .5 ,并持续表达至 3周。结论 :5 -aza在体外可诱导hMSC向心肌细胞分化 ,5 -aza可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hMSC心肌化的过程。

5-氮杂胞嘧啶核苷降低小麦成熟胚再生频率

为了研究组蛋白乙酰化对小麦再生的影响,以CB037、Fielder和中国春(CS)的成熟胚为外植体,在培养基中添加不同浓度的5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC),分析了胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率和绿芽诱导率。结果表明,添加50μmol/L 5-azaC,CB037绿芽诱导率为54.72%,与对照79.62%相比,下降水平达到极显著差异;添加10μmol/L和50μmol/L 5-azaC,Fielder胚性愈伤组织诱导率分别为39.13%和35.71%,绿芽诱导率分别为26.09%和25.14%,与对照相比,均有显著性差异的下降;CS在50μmol/L浓度处理时,胚性愈伤组织诱导率为23.89%,与对照30.95%相比,有显著性差异的下降。添加5-azaC降低小麦成熟胚再生频率;随着添加浓度升高,降低效果越明显。5-azaC对小麦再生频率的影响有基因型差异。

5-氮杂胞嘧啶核苷联合hepaCAM腺病毒通过抑制p-AKT诱导膀胱癌细胞T24凋亡

目的:研究5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine,azac)联合肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)腺病毒对膀胱癌细胞T24凋亡的影响及可能机制的探讨。方法:7种不同因素分别处理培养的膀胱癌细胞T24,hoechst 33258染色检测各处理组细胞凋亡率,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞早期凋亡率,RT-PCR检测hepaCAM及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,bcl-2)mRNA的表达,Western blot检测hepaCAM、p-AKT、total-AKT、bcl-2蛋白的表达。结果:hoechst 33258显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞凋亡率为(45.21±0.06)%,明显高于hepaCAM腺病毒组(15.60±0.02)%和azac组(26.30±0.02)%,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.008);FCM显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞早期凋亡率为(16.05±0.06)%,明显高于hepaCAM腺病毒组(3.90±0.02)%和azac组(9.67±0.02)%,差异有统计学意义(P=0.002,P=0.043);RT-PCR显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac与hepaCAM腺病毒联用可以上调hepaCAM mRNA的表达(P=0.004,P=0.000),下调bcl-2 mRNA的表达,差异有统计学意义(P=0.026,P=0.030);Western blot显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac联合hepaCAM腺病毒组可上调hepaCAM蛋白的表达(P=0.003,P=0.003),同时下调p-AKT(P=0.001,P=0.005)和bcl-2(P=0.000,P=0.002)蛋白的表达,差异有统计学意义。结论:azac联合hepaCAM腺病毒可能通过抑制p-AKT的磷酸化水平加速诱导T24细胞凋亡,可为膀胱癌的治疗提供新的思路。

离体条件下5-氮杂胞嘧啶核苷对菊花DNA甲基化和表型性状的影响

采用离体处理的方法,初步研究了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC)对菊花的影响。结果表明,500μmol.L-1以上时有致死效应,100μmol.L-1以上时能抑制离体材料的生长发育,而各浓度对菊花的丛生芽均具有抑制作用,且这种抑制作用具有时间累加效应和剂量累计效应。10μmol.L-1以下时使菊花开花时间有不同程度的提早,这一效应具有稳定性,并可通过营养繁殖进行遗传。MSAP技术分析表明,处理材料基因组DNA甲基化水平明显降低,在去处理后的继代过程中仍有部分位点保持低甲基化状态。

5-氮杂胞嘧啶核苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的研究5-氮杂胞嘧啶核苷（5-AZA）对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响。方法从小鼠股骨和胫骨骨髓中分离BMSCs；利用免疫荧光染色检测间充质干细胞特异性标记分子CD44和CD90在BMSCs上的表达；应用0、10和20μmol／L的5-AZA体外诱导培养BMSCs48h，应用4′，6-二眯基-2-苯基吲哚（DAPI）染色和荧光标记的半胱天冬酶抑制剂（FLICA）凋亡试剂盒检测5-AZA处理后细胞的凋亡率；应用Westernblot检测凋亡相关蛋白AnnexinV和Caspase-3在处理后的细胞表达水平。结果实验中，BMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记蛋白CD44和CD90。DAPI染色和Caspase-3染色均显示10和20μmol／L5-AZA可增加BMSC的凋亡率；对照组、10μmol／L组5-AZA和20μmol／L5-AZA组DAPI染色阳性凋亡率分别为（21．086±2．601）％、（34．467±3．724）％和（46．512±3．864）％，Caspase-3染色阳性凋亡率分别为（5．354±0．735）％、（15．4624-2．385）％和（28．190±4．190）％，组间比较差异均有统计学意义（P均＜0．01）。Westernblot检测显示AnnexinV和Caspase-3在5-AZA处理后表达均显著增高；对照组、10μmok／L组5-AZA和20μmol／L5-AZA组AnnexinV相对表达水平分别为（26．612±2．184）％、（42．873±4．313）％和（50．056±4．457）％，Caspase-3的相对表达水平分别为（19．231±2．683）％、（38．618±5．385）％和（91．235±7．116）％，组间比较差异均有统计学意义（P均＜0．01）。结论常规剂量的5-AZA可诱导BMSCs凋亡。

5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶对乳腺癌细胞CDH4启动子去甲基化的作用

背景与目的:钙黏素(cadherin,CDH)是一类重要的细胞黏附分子,CDH4在恶性肿瘤中表达下降的重要机制之一是基因启动子区的异常甲基化。本研究旨在探讨5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)诱导人乳腺癌细胞株MCF-7中CDH4基因启动子去甲基化后该基因恢复表达情况及功能状态。方法:5-Aza-CdR作用MCF-7细胞后,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测5-Aza-CdR对MCF-7细胞CDH4启动子甲基化的影响,RT-PCR检测5-Aza-CdR作用前后MCF-7细胞中CDH4的表达,MTT法检测MCF-7细胞的存活率,并通过划痕试验检测5-Aza-CdR处理前后MCF-7细胞迁移力的变化。结果:5-Aza-CdR逆转了MCF-7细胞CDH4的甲基化状态,CDH4 mRNA表达恢复,且恢复表达程度与5-Aza-CdR药物浓度呈正比,经不同浓度(10、20和40μmol/L)处理后,MCF-7细胞的增殖速度明显减慢,与5-Aza-CdR浓度为0μmol/L的对照组比较,各处理组细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),明显抑制了MCF-7细胞的迁移力。结论:CDH4启动子甲基化导致细胞株MCF-7中CDH4表达沉默,5-Aza-CdR能重新激活乳腺癌细胞株MCF-7细胞中CDH4的表达,抑制MCF-7细胞增殖和迁移,这可能是其引起乳腺癌细胞株MCF-7生物学行为改变的机制之一。

5-杂氮脱氧胞嘧啶对卵巢癌细胞株增殖和肿瘤特异性抗原表达的影响

目的探讨5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)对卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1增殖和肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的影响。方法将处于对数生长期的卵巢癌细胞系与5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)共同培养,观察细胞生长指数并利用流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡情况,应用RT-PCR法检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1在DAC作用前后肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的变化。结果DAC能抑制卵巢癌细胞株的增殖,使大多数细胞阻滞在G0期,并使肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE阳性表达率提高。结论DAC可以提高卵巢癌细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE的阳性表达率,扩大卵巢癌免疫治疗的应用范围。

干扰素α、5-AZA-CdR对白血病细胞HL-60和K562的作用

【目的】探讨细胞因子干扰素α(INFα)和甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA-CdR)对白血病细胞HL-60和K562的作用机制。【方法】1000U/mL INFα和不同剂量的5-AZA-CdR作用于HL-60和K562 48h,通过RT-PCR检测Xaf1和XIAP mRNA的表达,流式细胞技术检测Bcl-2家族成员、线粒体膜电位(Δψm)和细胞凋亡的情况。【结果】INFα和5-AZA-CdR使HL-60和K562 Xaf1 mRNA表达增加,且与5-AZA-CdR呈剂量依赖性,其中5-AZA-CdR(5μmol/L)的作用最明显;XIAP mRNA表达无变化。INFα使HL-60和K562 Bax表达增加,Bcl-2和Bcl-xl表达无改变;5-AZA-CdR降低HL-60 Bcl-2、Bcl-xl、Bax表达,增加K562 Bax表达,不影响K562 Bcl-2和Bcl-xl。INFα和5-AZA-CdR都能使线粒体膜电位降低、细胞凋亡增加。除细胞凋亡外INFα和5-AZA-CdR对HL-60和K562的Xaf1 mRNA、Bcl-2家族成员以及Δψm无协同作用。【结论】INFα和5-AZA-CdR促进HL-60和K562细胞凋亡,其作用机制可能与上调Xaf1 mRNA的表达,下调Bcl-2(Bcl-xl)/Bax和降低线粒体膜电位有关。

5-AZA-CdR联合EGCG对HL-60和K562的影响

目的探讨细胞因子INFα和甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA-CdR)能否诱导HL-60和K562 Xaf1表达,以及Xaf1表达诱导剂联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否具有协同抗癌作用。方法(1)1000U/mlINFα和不同剂量的5-AZA-CdR作用于HL-60和K56248h,通过RT-PCR检测Xaf1和XIAP mRNA的表达并比较差异。(2)最佳Xaf1表达诱导剂联合EGCG作用于白血病细胞,流式细胞技术检测Bcl-2家族成员、线粒体膜电位和细胞凋亡的情况。结果(1)随5-AZA-CdR剂量增加,HL-60和K562Xaf1 mRNA表达增加,INFα也能诱导Xaf1表达,以5-AZA-CdR(5μmol/L)的作用最强;INFα和5-AZA-CdR均不影响XIAP mRNA的表达。(2)5-AZA-CdR和EGCG可改变HL-60和K562细胞Bcl-2(Bcl-xl)和Bax的表达,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡,二者联合作用被加强。结论(1)INFα和5-AZA-CdR能诱导HL-60和K562Xaf1 mRNA的表达,且5-AZA-CdR的作用具有剂量依赖性。(2)5-AZA-CdR和EGCG在体外能诱导白血病细胞凋亡,并具有协同效应。

5-Aza诱导骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死及对凋亡蛋白的影响

目的探讨5-Aza诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗大鼠心肌梗死及对凋亡蛋白的影响机制。方法构建SD大鼠心肌梗死模型随机分为4组,每组15只:对照组、模型组、MSCs组和5-Aza-MSCs组。分离获取MSCs并进行体外增殖,5-Aza-MSCs组用5-Aza进行趋化诱导BMSCs分化为心肌细胞,并给予治疗组大鼠移植。HE染色法观察心肌组织病理学改变;采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡的发生;采用Caspase 3活性检测试剂盒检测凋亡蛋白Caspase-3表达;采用Western blot法检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、Bak蛋白的表达。结果 MSCs组和5-AZA-MSCs组心肌凋亡数量比模型组显著降低,5-Aza-MSC组心肌凋亡数量最低(P<0.05)。MSCs组和5-AZAMSCs组Bcl-2、Bcl-xl蛋白含量表达比模型组显著上升,Bax、Bad、Bak蛋白表达明显下降,5-AZA-MSCs组更为明显(P<0.05),5-AZA-MSCs组bcl-2/bax的比值最大,说明5-AZA-MSCs组抗凋亡能力最强。MSCs组和5-AZA-MSCs组Caspase 3含量比模型组显著降低,5-AZA-MSCs组下降更为明显(P<0.05)。结论 5-Aza诱导MSCs向心肌细胞分化,并可有效改善大鼠心肌梗死,抑制促凋亡蛋白的表达。

骨髓基质干细胞心肌化诱导过程中转录因子NKx2.5的表达

目的 :研究 5 -氮杂胞嘧啶 (5 -azacytidine,5 -aza)和二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)诱导人骨髓基质细胞 (humanbonemarrowstromalcells ,hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子NKx 2 .5表达的变化。方法 :取传至第 8代hMSC ,以3μmol/L的 5 -aza和DMSO诱导 2 4h。 1周后重复诱导 1次。在诱导后 1、2和 3周 3个时间点以半定量RT -PCR方法检测细胞心肌特异转录因子NKx 2 .5的表达变化。结果 : hMSC经 5 -aza诱导后 ,约 1周左右细胞明显变大 ,2周时细胞走向趋于一致 ,邻近细胞间连接较前紧密 ,并形成肌节样结构。RT -PCR的结果显示 ,5 -aza可诱导心肌特异转录因子NKx 2 .5 ,并一直持续表达 3周。在DMSO诱导hBMSC后 1周 ,开始可检测到细胞发生转录水平变化NKx 2 .5表达 ,并均可持续表达至诱导后 3周 ;NKx 2 .5表达量有随诱导后时间延长而增加的趋势。结论 :5 -aza和DMSO在体外可诱导心肌特异转录因子NKx 2 .5的表达 ,从而启动hMSC心肌化的过程。

5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷联合吉西他滨对胰腺癌细胞株原钙黏蛋白8基因表达的影响

目的研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷（5-Aza—CdR）对胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8（protocadherin8，PCDH8）基因DNA启动子甲基化的转录调控，以及联合吉西他滨对癌细胞生长抑制与凋亡的影响。方法采用MTT法、流式细胞术检测5-Aza—CdR及联合吉西他滨对Capan-2细胞的抑制率与凋亡率。应用甲基化特异性PCR（MSP）、RT—PCR和Westernblot的方法检测不同浓度5-Aza—CdR处理细胞前后PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达水平和蛋白表达水平。结果5-Aza-CdR能使胰腺癌细胞Capan-2增长速度减慢，呈浓度依赖性，联合吉西他滨显著抑制细胞生长；5-Aza—CdR联合吉西他滨与单药组、对照组相比，可显著诱导细胞凋亡。不同浓度的5-Aza—CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞Capan-2的甲基化，恢复mRNA表达水平和蛋白表达水平，并呈一定的浓度正相关。结论5-Aza—CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2的高甲基化状态，解除DNA高甲基化导致的基因沉默，重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达，同时可抑制胰腺癌细胞生长，与吉西他滨有协同抗肿瘤作用。

miR1-2诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中的Wnt/β-catenin信号通路

背景:骨髓间充质干细胞具有向心肌细胞分化的潜能,但其分化率较低,且其分化机制尚不完全明确。目的:探讨miR1-2在小鼠骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞中的作用,揭示此过程中涉及的信号通路。方法:用miR1-2和5-氮杂胞嘧啶处理小鼠骨髓间充质干细胞。通过q PCR检测心肌细胞标志物GATA4在骨髓间充质干细胞中的表达。流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过测定该信号通路的上游蛋白评价Wnt/β-catenin信号通路的活性。结果与结论:(1)miR1-2模拟物转染骨髓间充质干细胞24 h后,miR1-2在骨髓间充质干细胞中的表达显著增加。miR-2模拟物处理48 h后,骨髓间充质干细胞的凋亡率无显著差异;(2)转染miR1-2模拟物48 h后,与对照组相比,GATA4的表达随着时间的延长显著增加,处理72 h后,这些基因在miR1-2组中的表达显著高于5-氮杂胞嘧啶组和对照组;(3)与miR1-2-mimics-NC相比,用miR1-2模拟物处理后,β-catenin和Wnt11的m RNA和蛋白相对表达均显著增加,而添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LGK-974后,β-catenin和Wnt11的相对表达量均显著降低;(4)结果提示,骨髓间充质干细胞中miR1-2可以更有效地诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并且与Wnt/β-catenin信号通路活性有关。

去甲基化和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂对K562细胞增殖和肿瘤相关基因表达的影响

为观察去甲基化和组蛋白乙酰化对白血病细胞系K5 6 2增殖及肿瘤相关基因表达的影响 ,本研究将处于对数生长期的K5 6 2细胞系与 5 杂氮脱氧胞嘧啶 (DAC)和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂—曲古抑菌素 (trichostatin ,TSA)共同培养 ,观察细胞生长指数并利用流式细胞术检测细胞周期变化 ;利用Atlas774 2 1基因芯片筛查给药前后的基因表达差异。结果表明 ,DAC和TSA的联合应用能够抑制K5 6 2细胞的增殖 ,使大多数细胞阻滞在G0 期 ,并促进多个基因的表达上调及少数基因表达下调。结论 :去甲基化药物及组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂联合应用具有抗白血病作用 ,与基因芯片联合应用可以用来筛查白血病抑癌候选基因。

骨髓增生异常综合征P15^(INK4B)基因甲基化及药物去甲基化作用

目的检测骨髓增生异常综合征(M DS)患者P 15INK 4B基因甲基化状况;探讨5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶(dec itab ine)和三氧化二砷(A s2O3)对M DS患者细胞的去甲基化作用。方法采用限制性内切酶联合PCR方法检测14例M DS患者P 15INK 4B基因甲基化,选择1例由M DS转化为急性白血病患者的外周血单个核细胞,分组分别加入dec itab ine和A s2O3进行处理,分析甲基化程度变化情况。结果低危组M DS患者(RCM D)均未发现P 15INK 4B基因甲基化,4例高危组M DS患者(RAEB)和4例M DS-AL患者发现P 15INK 4B基因甲基化。经dec itab ine和A s2O3处理后,M DS患者细胞的甲基化程度均降低50%左右。结论M DS的发生与P 15INK 4B基因甲基化密切相关,dec itab ine和A s2O3均对M DS患者细胞高度甲基化的P 15INK 4B基因具明显去甲基化作用。

DNA甲基化抑制剂作用机理及其在植物发育生物学研究中的应用

本文综述了DNA甲基化抑制剂作用机理及其在植物发育生物学研究中的应用。DNA甲基化抑制剂使甲基基团不能转移到腺嘌呤或胞嘧啶,导致DNA甲基化反应受阻,从而使基因组甲基化水平降低。DNA甲基化抑制剂已被用于因DNA甲基化引起的植物表观遗传研究中,同时它可以代替低温促进植物提早开花,并可能在植物性状改良中得到进一步的研究和应用。

骨髓源性心肌细胞瞬间外向钾电流状态的研究

目的:研究骨髓源性心肌细胞的膜瞬间外向钾电流(Ito)的状态。方法:取健康SD大鼠的骨髓,经梯度离心和贴壁培养获得骨髓基质干细胞,再以3μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导,利用膜片钳技术,以正常大鼠心室肌细胞为对照,以全细胞记录模式记录骨髓基质干细胞和骨髓源性心肌细胞的膜瞬间外向钾电流。结果:骨髓基质干细胞体外经5-aza诱导后表达心肌特异性蛋白,在诱导14d后的细胞,可记录到动作电位;骨髓基质干细胞在5-aza诱导前即可记录到Ito,但不同细胞间电流密度差别较大,为15.89±11.18pA/pF(n=12);与骨髓基质干细胞相比骨髓源性心肌细胞Ito电流密度(20.45±8.91pA/pF,n=5)较诱导前有增加的趋势,两者有显著差异;Ito电流的密度与心室肌细胞(21.69±7.73pA/pF,n=20)无显著差异。结论:5-aza可在体外有效诱导大鼠骨髓基质干细胞心肌化,与心室肌细胞相比,骨髓源性心肌细胞膜Ito电流密度无显著差异。

DNA甲基化与白血病的研究进展

DNA异常甲基化是人类肿瘤中最常见的基因变化之一,它在白血病发生、发展中对基因表达调控、基因结构的稳定等方面发挥重要作用。白血病去甲基化治疗是建立在白血病甲基化研究基础上,是一种作用机理不同于传统化疗药物的新方法,它对复发及耐药白血病有一定疗效。本文就近年来在DNA甲基化与白血病发生的关系及白血病去甲基化治疗方面的研究进展作一综述。

DAC对卵巢癌细胞株增殖及其MAGE、BAGE、GAGE基因表达的影响

目的探讨5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)对卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1增殖及其肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE基因表达的影响。方法将对数生长期的卵巢癌细胞株与DAC共同培养,观察细胞生长指数,利用流式细胞术检测细胞周期,RT-PCR技术检测卵巢癌细胞株在DAC作用前后MAGE、BAGE、GAGE基因的表达。结果DAC能使大多数巢癌细胞株阻滞在G0期,并使其MAGE、BAGE、GAGE基因表达增加。结论DAC能抑制卵巢癌细胞株的增殖,提高其肿瘤特异性抗原基因的表达。