5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶对乳腺癌细胞CDH4启动子去甲基化的作用

背景与目的:钙黏素(cadherin,CDH)是一类重要的细胞黏附分子,CDH4在恶性肿瘤中表达下降的重要机制之一是基因启动子区的异常甲基化。本研究旨在探讨5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)诱导人乳腺癌细胞株MCF-7中CDH4基因启动子去甲基化后该基因恢复表达情况及功能状态。方法:5-Aza-CdR作用MCF-7细胞后,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测5-Aza-CdR对MCF-7细胞CDH4启动子甲基化的影响,RT-PCR检测5-Aza-CdR作用前后MCF-7细胞中CDH4的表达,MTT法检测MCF-7细胞的存活率,并通过划痕试验检测5-Aza-CdR处理前后MCF-7细胞迁移力的变化。结果:5-Aza-CdR逆转了MCF-7细胞CDH4的甲基化状态,CDH4 mRNA表达恢复,且恢复表达程度与5-Aza-CdR药物浓度呈正比,经不同浓度(10、20和40μmol/L)处理后,MCF-7细胞的增殖速度明显减慢,与5-Aza-CdR浓度为0μmol/L的对照组比较,各处理组细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),明显抑制了MCF-7细胞的迁移力。结论:CDH4启动子甲基化导致细胞株MCF-7中CDH4表达沉默,5-Aza-CdR能重新激活乳腺癌细胞株MCF-7细胞中CDH4的表达,抑制MCF-7细胞增殖和迁移,这可能是其引起乳腺癌细胞株MCF-7生物学行为改变的机制之一。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷调控HOXA10对子宫内膜异位症患者在位内膜容受性的影响

目的:研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,AZA)对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜容受性的影响。方法:体外原代培养内异症子宫内膜上皮细胞,AZA作用24h后,亚硫酸氢盐测序法(BisulfiteSequencing)检测HOXA10的甲基化水平的变化;实时定量PCR和Western Blot方法检测HOXA的转录和蛋白水平的变化。结果:AZA作用24h后,子宫内膜上皮细胞HOXA10的甲基化水平下降;同时HOXA10的表达增加。结论:AZA可通过抑制内异症子宫内膜上皮细胞中HOXA10的高甲基化,上调HOXA10的表达,从而促进子宫内膜容受性的建立。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞。hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受。本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂—5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'——deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用。方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化。MTT法检测药物对细胞增殖的影响。结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化。单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显。COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达。TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05)。联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05)。5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05)。结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导裸鼠HepG2种植瘤细胞T-cadherin的表达及其对种植瘤的抑制作用

目的:探讨去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)在裸鼠体内诱导HepG2细胞T-cadherin的表达,及其对HepG2种植瘤生长的抑制作用.方法:皮下接种法建立HepG2细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(11只)和对照组(10只).实验组裸鼠给予5-Aza-CdR注射,对照组裸鼠注射等量PBS.4wk后处死裸鼠,观察种植瘤的生长情况,用RT-PCR技术及免疫组织化学技术检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达.结果:用药4wk后,实验组肿瘤组织的T-cadherin mRNA的表达水平显著高于对照组(t=6.613,P<0.05);对照组HepG2细胞几乎检测不到T-cadherin蛋白表达,而实验组裸鼠种植瘤细胞膜上可检测到T-cadherin蛋白表达;实验组肿瘤的平均体积明显小于对照组肿瘤平均体积(t=2.337,P=0.025).结论:5-Aza-CdR能诱导裸鼠皮下种植HepG2瘤细胞的T-cadherin表达,抑制HepG2种植瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的T-cadherin启动子去甲基化,恢复T-cadherin的表达,从而抑制HepG2种植瘤生长.

5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨

目的:探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点。方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线。用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associatedproteinkinaseDAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P>0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P<0.01)。在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长。

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-CdR)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用0.5、1.0、1.5μmol/L浓度的5'-Aza-CdR处理CRC细胞株HT-29和LoVo。应用MethyLight方法、实时荧光定量PCR方法及蛋白印迹试验(Westernblot)检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中MGMT基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达情况。结果 MethyLight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转。实时荧光定量PCR检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组HT-29细胞株和LoVo细胞株MGMT基因mRNA表达水平均较对照组上调,Western blot检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组MGMT蛋白表达水平均较对照组上调,且均具有药物剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论 CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能够逆转CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对腺样囊性癌细胞RECK基因表达及细胞侵袭力的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine,5-aza-d C)对腺样囊性癌细胞中RECK基因表达及肿瘤侵袭力的影响。方法:采用甲基化特异性PCR、实时定量PCR、Western印记检测腺样囊性癌细胞中RECK基因的甲基化状态及RECK基因mRNA和蛋白的表达,transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果:RECK基因甲基化条带仅在ACC-M细胞中发现,经5-aza-d C处理后ACC-M细胞中RECK基因甲基化得到逆转,RECK基因mRNA及蛋白的表达显著提升。ACC-M细胞的侵袭力明显降低。结论:5-aza-d C可逆转腺样囊性癌ACC-M细胞中RECK基因的高甲基化状态并恢复RECK基因mRNA及蛋白的表达,抑制ACC-M细胞侵袭力。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.方法:使用1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化,且EDNRB mRNA不表达,经1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR处理4d后,EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转,细胞中EDNRB mRNA表达恢复.4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;并抑制SGC-7901细胞生长周期,其细胞周期阻滞于S期,5、10μmol/L5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且差异有统计学意义(7.13%±0.87%,13.34%±1.12% vs 3.69%±0.52%,P=0.032,P<0.001).结论:5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制该细胞的生长.

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对食管鳞癌ECa109细胞增殖及TIG1基因表达与甲基化状态的影响

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxy-cytidine,5-aza-CdR)对食管鳞癌细胞株ECa109增殖抑制作用,以及对ECa109中TIG1基因甲基化状态及其mRNA表达的影响。方法:实验组分别使用10、20、50、100μmol/L的5-aza-CdR处理ECa109细胞,对照组用不添加5-aza-CdR培养基培养;采用MTT法检测两组细胞生存率的变化;MSP检测TIG1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测TIG1基因mRNA表达水平。结果:5-aza-CdR可以显著抑制ECa109的生长,实验组细胞生存率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组同种药物浓度,作用时间延长,生存率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);同一作用时间,随着药物浓度增加,细胞生存率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组ECa109细胞TIG1基因处于高甲基化状态,经过10μmol/L及20μmol/L的5-aza-CdR处理细胞株120h后,TIG1基因的甲基化部分解除。对照组ECa109细胞中无TIG1 mRNA表达,采用10μmol/L及20μmol/L浓度药物处理72、120、168h后细胞株中TIG1 mRNA恢复表达,且20μmol/L处理组细胞较10μmol/L组TIG1 mRNA表达增强。结论:5-aza-CdR可以抑制ECa109细胞生长,且具有剂量及时间依赖性;ECa109中TIG1基因甲基化阳性,其mRNA的表达缺失;经5-aza-CdR干预后可使TIG1基因发生去甲基化修饰,恢复表达,去甲基化修饰具有时间及剂量依赖效应。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响

目的研究5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响及其机制。方法用浓度为50μmol/L的5-Aza-CdR处理HepG2细胞72 h后,流式细胞仪分析HepG2细胞周期的分布和凋亡的情况;transwell实验检测细胞侵袭能力;RT-PCR检测肝癌中失活的抑癌基因SIAH1 mRNA表达量的变化。并与未经任何药物处理的正常HepG2细胞相比。结果与正常HepG2细胞相比,5-Aza-CdR处理后的HepG2细胞周期阻滞于S期(P<0.05),细胞早期凋亡率增加(P<0.05),且细胞体外侵袭力减弱(P<0.05),SIAH1基因的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR可能通过上调SIAH1的表达,调控细胞周期并诱导细胞凋亡,同时抑制HepG2细胞体外侵袭能力。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合多西紫杉醇对前列腺癌细胞系PC3恶性表型抑制作用的实验研究

目的:观察甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dc)联合多西紫杉醇(DT)对人前列腺癌(PCa)细胞系PC3细胞增殖、迁移、侵袭能力、细胞周期变化和细胞凋亡的影响,探讨上述两种药物联合应用对前列腺癌细胞的体外抗肿瘤效应。方法:实验分为对照组、5-aza-2dc组、DT组及5-aza-2dc和DT联合用药组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、划痕损伤实验、细胞迁移实验分别观察5-aza-2dc和(或)DT对PC3细胞株增殖、迁移、侵袭能力的抑制效应,利用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其与细胞周期的关系。结果:5-aza-2dc组、DT组及联合用药组均能明显提高对PC3细胞的抑制率,降低细胞迁移距离,减少侵入下室的细胞(P<0.05),联合用药组作用更明显;对照组、5-aza-2dc组、DT组及联合用药组细胞凋亡率分别为(10.65±0.39)%、(16.60±0.67)%、(17.95±1.08)%、(22.98±1.18)%,各用药组均能明显提高细胞凋亡率,联合用药组作用更明显(P<0.05);联合用药组能明显减少G0/G1期细胞,增加G2/M期细胞(P<0.05)。结论:5-aza-2dc和DT单独及联合应用均能在体外细胞水平显著抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭作用,诱导细胞凋亡,使细胞停滞于G2/M期,两药联合的作用比各单药作用大,5-aza-2dc和DT联合作用于PC3细胞具有协同作用,值得进一步研究。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2中抑癌基因MIA2表达的影响

目的应用甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作用肝癌细胞株HepG2,观察其对细胞增殖和凋亡的影响,并观察用药后肝癌细胞中黑色素瘤抑制蛋白2(melanoma inhibitory activity 2,MIA2)表达的变化情况。方法分别以浓度0、1、2、4、8、10、20、40μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。再以0μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,细胞免疫组化和Western blot检测细胞中MIA2蛋白表达。结果 5-Aza-CdR作用HepG2后,MTT结果显示细胞增殖受到抑制,在一定药物浓度范围内,细胞增殖抑制率和药物浓度呈正相关;流式细胞术结果显示细胞早期凋亡增加,在一定药物浓度范围内,早期凋亡率和药物浓度呈正相关;细胞免疫组化和Western blot结果显示与对照组(0μmol/L)比较,10μmol/L组中MIA2蛋白表达增强。结论 5-Aza-CdR作用HepG2细胞后,MIA2蛋白表达明显增强,细胞增殖受到抑制,早期凋亡增加。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人HL-60细胞DAPK基因表达的影响

本研究旨在观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞株HL-60凋亡及死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因表达的影响,探讨5-aza-2dC治疗AML的作用机制。不同浓度的5-aza-2dC处理HL-60细胞后,采用瑞式染色法观察5-aza-2dC对HL-60细胞形态的影响,流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测5-aza-2dC对HL-60细胞DAPK基因表达的影响。结果表明,①5-aza-2dC呈浓度依赖性地促进HL-60细胞凋亡;②经5-aza-2dC处理后,HL-60细胞DAPK基因表达水平较处理前呈剂量依赖性地增加。结论:随着5-aza-2dC作用浓度的增加,HL-60细胞的凋亡率及DAPK基因表达水平均逐渐增加,提示DAPK基因可能是5-aza-2dC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之一。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法分别用低、中、高浓度5-Aza-CdR处理AGS,对照组不处理。CCK-8检测AGS细胞增殖状态,流式细胞仪检测AGS细胞周期及凋亡率,MSP检测AGS中DAPK基因启动子甲基化状态,RT-PCR和Western blot法分别检测AGS中的DAPKmRNA及其蛋白。结果低、中、高浓度组AGS细胞增殖速度显著低于对照组(P均<0.05),并呈浓度、时间依赖性(P均<0.05)。5-Aza-CdR使AGS细胞停滞在G0/G1期(P均<0.05),细胞凋亡率增加(P均<0.05)。对照组DAPK基因启动子表现甲基化状态,低、中、高浓度组DAPK基因启动子被逆转成未甲基化状态。低、中、高浓度组AGS细胞DAPK mRNA及蛋白表达量均显著高于对照组(P均<0.05),并呈浓度依赖性。结论 5-Aza-CdR可抑制AGS细胞增殖、促进其凋亡,可能与逆转DAPK基因启动子甲基化状态并使其重新表达有关。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞RAR-β基因去甲基化及其表达的作用

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肺腺癌SPC-A-1细胞视黄酸受体β(RAR-β)基因甲基化状态的影响,探讨不同浓度5-Aza-CdR对RAR-β基因表达缺陷的调控机制。方法将体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株分为4组,分别是A组(未加药)及B、C、D组(分别加入3、6、12μmol/L的5-Aza-CdR)。采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测4组细胞RAR-β基因甲基化状态的差异,RT-PCR法检测4组细胞RAR-βmRNA表达水平的差异,Western blot检测4组细胞RAR-β蛋白表达水平的差异,流式细胞仪技术检测各组细胞周期及细胞凋亡率的差异。结果 A组标本检测出RAR-β基因为甲基化状态,而B、C、D组均检测出RAR-β为去甲基化状态。肺腺癌SPC-A-1细胞RAR-βmRNA及RAR-β蛋白表达水平低下,经5-Aza-CdR处理后,其表达水平明显增强(P<0.01)。5-Aza-CdR处理后(B、C、D组)的细胞凋亡率均较A组明显提高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论肺癌RAR-β基因因甲基化出现表达缺陷,5-Aza-CdR具有明显去甲基化作用,可诱导RAR-β基因重新激活表达,促进肺癌细胞凋亡及抑制癌细胞增殖,从而发挥抗癌作用。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胰腺癌细胞株Capan-2增殖及其PCDH8基因表达的影响

目的探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株增殖的影响以及对其原钙黏附素(protocadherin 8,PCDH8)基因表达的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理胰腺癌Capan-2细胞。阴性对照组不加药,根据5-Aza-CdR处理的剂量分为:0.08μmol/L组、0.40μmol/L组、2.00μmol/L组、10μmol/L组、50μmol/L组,检测细胞的生长情况;采用RT-PCR和Western Blot检测各组胰腺癌细胞PCDH8基因和蛋白的表达。结果5-Aza-CdR对胰腺癌细胞具有明显的抑制作用,且随着浓度的增加,抑制率逐渐增强(P<0.01);但是随着时间的增加,抑制率逐渐下降(P<0.01)。5-Aza-CdR和吉西他滨联用对胰腺癌细胞的抑制作用和诱导凋亡作用最强(P<0.05,P<0.01)。5-Aza-CdR能显著增加胰腺癌细胞PCDH8基因和PCDH8蛋白的表达水平,且随着浓度的升高,增加作用越明显(P<0.01)。结论5-Aza-CdR能够抑制胰腺癌细胞的增殖,增加PCDH8基因的表达,与吉西他滨联合后抑制作用更强。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对卵巢癌HO8910细胞WWOX基因甲基化状态及其生物学行为的影响

目的:检测卵巢癌HO8910细胞株中WWOX基因甲基化状态,探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对WWOX基因甲基化状态及其对HO8910细胞株生物学行为的影响。方法:将HO8910细胞分为对照组与5-Aza-CdR处理组,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测两组细胞WWOX基因甲基化状态;蛋白印迹法检测两组细胞WWOX蛋白的表达。体外实验:分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、体外侵袭实验及流式细胞仪等分析5-Aza-CdR对HO8910细胞生物学活性的影响。体内实验:用处理前后的HO8910细胞株分别接种于BALB/c裸鼠腹腔,观察两组裸鼠的生存时间及肿瘤生长情况,并采用Western blot分别检测两组裸鼠肿瘤组织中WWOX蛋白的表达。结果:(1)WWOX基因在HO8910细胞株中呈甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后呈去甲基化状态。(2)Western blot检测结果显示,5-Aza-CdR处理组WWOX蛋白表达水平高于对照组(0.71±0.023 vs 0.13±0.012,P<0.05)。(3)5-Aza-CdR处理组各时间点的细胞增殖能力较对照组下降(P<0.05)。(4)体外侵袭实验显示,5-Aza-CdR处理组穿膜细胞数较对照组少(92.2±4.7 vs 172.1±5.2,P<0.05)。(5)流式细胞检测显示5-Aza-CdR处理组中67.13%的细胞阻滞于G0/G1期,较对照组高(21.52%,P<0.05)。(6)裸鼠体内实验表明,5-Aza-CdR处理组裸鼠体内的致瘤能力明显低于对照组,且5-Aza-CdR处理组WWOX蛋白表达水平明显高于对照组(0.65±0.031 vs 0.25±0.047,P<0.05)。结论:5-Aza-CdR能逆转HO8910细胞WWOX基因甲基化状态,并抑制细胞增殖。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人前列腺癌裸鼠移植瘤生长及雄激素受体表达影响的研究

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-CdR)对LNCaP荷瘤裸鼠的肿瘤生长及雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的影响。方法裸鼠皮下接种LNCaP细胞,建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型,待肿瘤长至300 mm3大小时,荷瘤裸鼠腹腔内注射5-Aza-CdR,0.25 mg/kg,隔天1次。对照组给予生理盐水注射。每3天测量肿瘤体积1次,共观察24天。实验结束时处死裸鼠,取出肿块称重后,肿瘤组织抽提RNA和蛋白质,分别应用实时定量PCR和western blot方法,检测AR在mRNA和蛋白质水平上的表达。结果 LNCaP荷瘤裸鼠经5-Aza-CdR治疗后,与对照组相比,肿瘤生长缓慢。第24天观察结束时,5-Aza-CdR处理组肿瘤体积[(982±83)mm3]显著低于对照组[(1 867±195)mm3](P<0.01)。移植瘤重量与对照组相比明显下降[(796±178)mg vs(1 267±252)mg],抑瘤率为37.2%,差异有统计学意义(P<0.01)。5-Aza-CdR组游离PSA(FPSA)浓度相对对照组显著下降,分别为(40.25±13.3)ng/mL和(79.7±13.2)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.01)。荷瘤裸鼠经5-Aza-CdR处理后,AR在mRNA水平上的表达下降为对照组的0.5倍,在蛋白质水平上的表达也显著降低(P<0.01)。结论 5-Aza-CdR能够有效抑制LN-CaP荷瘤裸鼠移植瘤的生长,并显著降低AR基因表达,为前列腺癌的去甲基化治疗提供了理论依据。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷与5-氟尿嘧啶的协同抗胃癌作用

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-Deoxycytidine,5-Aza-CdR)对胃癌细胞的作用,并进一步明确他与传统化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fu)之间的相互关系.方法:选取野生型P53的胃癌AGS和突变型P53的BGC-823细胞用2.5mol/L5-Aza-CdR分别处理0-96h,MTT检测5-Aza-CdR处理前后细胞活力的变化.为了进一步探讨5-Aza-CdR的抗胃癌作用机制,我们用AnnexinⅤ检测细胞早期凋亡、caspases活性检测凋亡诱导通路及Westernblot检测下游相关蛋白的表达.结果:与未用5-Aza-CdR处理的空白对照组细胞相比,5-Aza-CdR时间依赖性地抑制了胃癌AGS和BGC-823细胞的生长活性(P<0.01).在探讨其作用机制时我们发现,5-Aza-CdR的抗胃癌毒性作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的.但细胞的不同P53状态可触发不同的细胞凋亡路径:在野生型AGS细胞中,5-Aza-CdR的凋亡机制是通过内源性的凋亡通路(caspase9)所介导的;但在BGC-823细胞中,5-Aza-CdR的促凋亡效应是独立于caspase凋亡路径的,因为我们并未观察到5-Aza-CdR处理后细胞caspases活性及蛋白表达水平的增加.尤为有意义的是,当5-Aza-CdR与5-Fu联合应用后,他显著增加了AGS和BGC-823细胞对5-Fu的敏感性.结论:以上数据明显证明5-Aza-CdR可作为一种卓有成效的抗胃癌药,特别是他与传统化疗药的协同抗癌效应,将对5-Aza-CdR未来在临床上的应用提供实践指导意义.

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine)对结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法:用不同浓度5'-氮杂-2'-脱氧胞苷处理结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo。应用Taq Man探针为基础的实时定量PCR(Methylight)方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后HT-29和Lo Vo细胞中MLH-1基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。结果:Methylight检测HT-29细胞株中MLH-1蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后MLH-1基因mRNA和蛋白表达上调,实时荧光定量PCR检测对照组和不同浓度实验组在HT-29细胞株相对表达量分别为1.000±0.000、1.171±0.126、1.356±0.085和1.422±0.090;在Lo Vo细胞株相对表达量分别为1.000±0.000、1.117±0.094、1.273±0.062和1.285±0.070。Western blot检测MLH-1蛋白对照组和不同浓度实验组在HT-29细胞株相对表达量分别为0.114±0.033、0.365±0.040、0.831±0.041和0.849±0.051;Lo Vo细胞株相对表达量分别为0.602±0.020、0.621±0.028、0.934±0.029和1.057±0.045。以上作用均呈时间、剂量依赖性,MLH-1基因mRNA在HT-29细胞株表达(F=8.918,P=0.010)和Lo Vo细胞株表达(F=8.351,P=0.011)具有统计学意义。MLH-1蛋白表达在HT-29细胞株表达(F=226.825,P=0.000)和Lo Vo细胞株表达(F=153.642,P=0.000)亦具有统计学意义。结论:结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-氮杂-2'-脱氧胞苷能够较成功的逆转结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。