5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞。hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受。本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂—5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'——deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用。方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化。MTT法检测药物对细胞增殖的影响。结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化。单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显。COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达。TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05)。联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05)。5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05)。结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。

5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌SGC-7901细胞生长及CHFR基因表达水平的影响

背景与目的:抑癌基因甲基化具有可逆性,相关药物可逆转甲基化使失活的基因重新表达。本研究观察去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞活性及CHFR基因mRNA和蛋白表达水平的影响。方法:使用不同浓度的5-Aza-dC和(或)TSA处理SGC-7901细胞,分为对照组、TSA组(250 nmol/L)、5-Aza-dC组(5μmol/L)及TSA(250 nmol/L)联合5-Aza-dC(5μmol/L)组等4个组,采用台盼蓝染色法检测细胞活性,并利用RT-PCR及蛋白质印迹法(Westernblot)方法检测CHFR基因mRNA和蛋白表达的水平。结果:5-Aza-dC和TSA作用24、48、60和72 h后SGC-7901细胞活性均被抑制,且抑制率呈浓度和时间依赖性,两药联合作用更明显;SGC-7901细胞经5-Aza-dC单独或与TSA联合干预后,能提高CHFR基因mRNA和蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5-Aza-dC和(或)TSA均能抑制细胞活性,提高CHFR基因mRNA和蛋白表达水平,两药联合的效果比单药明显增加,为临床胃癌患者的化疗方案提供了实验依据。

5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌SNU-1细胞系中DLC-1基因启动子甲基化及mRNA表达的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycitydine,5-Aza-d C)联合曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对胃癌细胞株SNU-1中DLC-1基因的甲基化水平和mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)和实时荧光定量PCR,检测5-Aza-d C单药或联合TSA作用于SNU-1细胞后,DLC-1基因的甲基化水平及DLC-1基因mRNA表达量。结果对照组中DLC-1基因呈甲基化状态;5-Aza-d C药物干预组DLC-1基因出现明显的非甲基化条带,甲基化条带亮度减弱;TSA组条带无明显变化;5-Aza-d C+TSA组DLC-1基因甲基化条带明显减弱,且出现非甲基化条带。5-Aza-d C组DLC-1 mRNA表达量是对照组的2.22倍,TSA组DLC-1 mRNA表达量是对照组的2.20倍,5-Aza-d C+TSA组DLC-1 mRNA表达量是对照组的4.50倍(P<0.05)。结论5-Aza-d C能诱导胃癌细胞系SNU-1中DLC-1基因去甲基化,与TSA联用可提高DLC-1 mRNA表达。

5-氮杂-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对胃癌细胞SGC-7901MGMT表达及NF-κB活性的影响

目的研究5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycitydine,5-Aza-dC)及曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞增殖、凋亡及移植瘤生长的影响,从体内、体外观察抑癌基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达,核转录因子NF-κB活性的改变,探讨5-Aza-dC联合TSA用于胃癌临床治疗的可行性。方法实验分对照组、5-Aza-dC组、TSA组和5-Aza-dC联合TSA组,利用CCK-8增殖试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞术分析细胞凋亡,RT-PCR检测各组MGMT mRNA表达,Western blot检测MGMT、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65的磷酸化水平。结果 5-Aza-dC、TSA单独处理均可抑制SGC-7901细胞的生长和促进其凋亡,联合用药后效果更明显(P<0.05);与对照组相比,单药组移植瘤变化没有统计学意义(P>0.05),而联合用药组较单药组移植瘤变小;5-Aza-dC、TSA单独或联合处理SGC-7901细胞和裸鼠移植瘤后,与对照组比较,MGMT基因mRNA及蛋白表达水平均上调,联合用药比单独用药升高明显,NF-κB p65在各处理组中的表达量未发生变化,但其磷酸化程度较对照组下降,联合用药较单药下降更明显(P<0.05)。结论 5-Aza-dC与TSA发挥抑制胃癌生长的作用可能是通过抑制NF-κB的活性,提高MGMT基因的转录和表达而实现的,两药联合使用的抗癌效果更加明显。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古菌素A对人胃癌细胞株化疗敏感性的协同增强作用

目的探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)联合曲古菌素A(TSA)协同增强人胃癌细胞MKN-74化疗敏感性的作用及机制。方法以MTT法观察5-Aza-CdR和(或)TSA与氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(OXA)、伊立替康代谢产物SN38或吉西他滨(GEM)联合应用对MKN-74细胞生长的抑制;流式细胞术分析细胞凋亡情况;RT-PCR检测p21、caspase3、Rb和p16基因表达,经Bandscan4.3分析软件进行条带灰度分析,计算目的基因与GAPDH灰度比值。结果5-Aza-CdR联合TSA可进一步增强5-Aza-CdR对5-FU、PTX、OXA或GEM的化疗增敏作用,也可以增强TSA对OXA、GEM的化疗增敏作用。TSA+OXA组、5-Aza-CdR+OXA组与5-Aza-CdR+TSA+OXA组的细胞凋亡率分别为28.07%±2.37%、25.33%±2.84%及38.37%±3.23%;TSA+GEM组、5-Aza-CdR+GEM组与5-Aza-CdR+TSA+GEM组的细胞凋亡率分别为17.20%±2.07%、19.30%±2.95%、29.57%±3.10%(P<0.05),说明5-Aza-CdR联合TSA协同可以促进OXA或GEM诱导MKN-74细胞凋亡。5-Aza-CdR联合TSA还可以增强caspase3、p16、Rb和p21基因的表达,与对照组(以其灰度值为1.00)相比,4种基因的表达分别为2.67、2.28、2.39和2.75。结论5-Aza-CdR联合TSA可能通过协同调控基因表达、诱导细胞凋亡,提高胃癌细胞的化疗敏感性。

5-氮-2′-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对子宫内膜腺癌细胞的抑制作用

目的:研究去甲基化制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)在体内外对子宫内膜腺癌Ishikawa细胞的抑制作用。方法:以5-Aza-CdR和TSA单独或联合作用Ishikawa细胞,锥虫蓝拒染法观察药物对肿瘤细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡和分析细胞周期,Western blotting检测肿瘤细胞凋亡信号通路中caspase-8活化及多聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解情况。建立裸鼠Ishikawa细胞移植瘤模型,观察两抑制剂作用下的移植成瘤率、肿瘤的体积和重量。结果:5-Aza-CdR和TSA对Ishikawa细胞增殖有明显的抑制作用,呈剂量、时间依赖性;两制剂联合作用时抑制作用更强(P<0.05)。5-Aza-CdR或TSA均可诱导细胞凋亡,联合作用后细胞的凋亡率更高(P<0.05);5-Aza-CdR和TSA联合应用使细胞发生明显的G1期阻滞;5-Aza-CdR和TSA诱导了caspase-8活化及PARP裂解。荷瘤小鼠予5-Aza-CdR和TSA治疗后移植瘤生长速度减慢,移植瘤体积和重量明显减少。结论:5-Aza-CdR与TSA能抑制Ishikawa肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡,两者联合作用时强度明显增加;其机制与两制剂诱导caspase-8活化及PARP裂解有关。

5-氮-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌细胞系MGC-803生物学行为的影响

目的:探讨5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和曲古抑菌素A(TSA)对人胃癌细胞系MGC-803生物学行为的影响.方法:人胃癌细胞系MGC-803按常规培养于含100g/L小牛血清的RPMI1640培养液中.实验分为5组:(1)空白对照组:不含细胞的培养液;(2)阴性对照组:细胞只换液,不加药物;(3)5-Aza-CdR组:细胞接种24h后,加入10.0μmol/L的5-Aza-CdR;(4)TSA组:细胞接种24h后,加入300μg/LTSA;(5)5-Aza-CdR+TSA组:细胞接种24h后,加入10.0μmol/L5-Aza-CdR,24h后再加入300μg/LTSA.应用RT-PCR检测各组细胞培养72h后细胞Runx3 mRNA的表达,MTT比色法测定各组细胞分别培养24、48、72h后细胞增殖.结果:单独应用5-Aza-CdR和TSA作用于MGC-803细胞72h后,Runx3 mRNA相对表达量增加,联合用药组分别与5-Aza-CdR组及TSA组相比,差异有统计学意义(0.883±0.025 vs 0.760±0.286,0.735±0.018,均P<0.05).细胞生长抑制率在同一组别随着药物作用时间的延长而增加,并且呈正相关(r=0.738,P<0.05);而在同一时间不同组别比较联合用药组细胞生长抑制率较单用药物组明显增加(24h:57.3% vs 40.4%,39.0%;48h:70.0% vs 56.0%,51.3%;72h:86.3% vs 68.0%,65.8%,均P<0.05).细胞Runx3 mRNA的相对表达量及生长抑制率在药物组与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:与单用5-Aza-CdR或TSA相比,联合应用2种药物更显著的增强Runx3 mRNA的表达,抑制细胞的增殖.

5-氮-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌细胞系MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人胃癌细胞系MGC-803经DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)作用后细胞增殖和凋亡变化。方法MTT比色法测定各组细胞的增殖情况,Annexin V染色法检测各组细胞凋亡率。结果单独应用5-Aza-CdR或TSA作用于胃癌细胞系MGC-803后,细胞增殖均受到抑制,生长抑制率分别为68.0%、65.8%;凋亡率分别为(42.31±4.53)%、(39.30±5.37)%,而联合用药组细胞生长抑制率明显增加,达到86.3%,细胞凋亡率为(68.20±7.14)%。结论与单用5-Aza-CdR或TSA相比,联合应用两种药物更能显著的诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,这可能为胃癌的生物治疗提供一种新的思路。

曲古抑菌素A和5-氮杂-2'-脱氧胞苷对猪孤雌胚胎发育的影响

为了研究曲古抑菌素A(TSA)和5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对猪孤雌胚胎发育及胚胎质量的影响,试验采用猪卵母细胞孤雌激活的方法,孤雌激活后在胚胎培养液中分别添加不同浓度TSA和5-Aza-CdR,比较其对猪孤雌胚胎发育的影响。结果表明:40 nmol/L TSA处理24 h能显著提高孤雌胚胎的囊胚率及囊胚细胞个数(P<0.05),卵裂率无明显变化(P>0.05);30 nmol/L5-Aza-CdR处理48 h能显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05),卵裂率与囊胚细胞个数均无明显变化(P>0.05)。说明在一定浓度条件下,TSA和5-Aza-CdR对猪孤雌胚胎发育的囊胚率有显著促进作用,5-Aza-CdR处理对卵裂率、囊胚细胞个数的影响不大,但TSA处理可以明显提高囊胚细胞个数,从而提高胚胎质量。

5-氮杂-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对胃癌MGMT基因表达及NF-κB活性的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)和曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对不同分化程度的人胃癌MKN-45和MGC-803细胞系增殖、凋亡,抑癌基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase,MGMT)甲基化水平及其核转录因子NF-κB磷酸化程度影响。方法利用CCK-8、流式细胞术、MSP、RT-PCR、Western blot等方法检测5-Aza-dC(10μmol/L)、TSA(1μmol/L)单独或联合刺激后,MKN-45和MGC-803细胞增殖、凋亡,MGMT甲基化、mRNA、蛋白表达水平及NF-κB p65蛋白的磷酸化程度。结果①5-Aza-dC、TSA单独或联合使用均可抑制MKN-45和MGC-803细胞的生长,与单药组相比,联合用药组抑制作用更明显(P<0.05);②5-Aza-dC及TSA均可促进MKN-45和MGC-803细胞的凋亡,联合用药组凋亡率[(8.43±1.80)%和(21.75±3.06)%]均明显高于5-Aza-dc组[(7.33±1.18)%、(15.22±1.03)%]和TSA组[(3.53±1.18)%、(12.66±1.10)%](P<0.05);③5-AzadC、TSA单独或联合刺激均可逆转MGMT基因甲基化,使其mRNA及蛋白表达水平上调,联合用药作用更加明显(P<0.05);④NF-κB活性高表达的MKN-45和MGC-803经5-Aza-dC和TSA处理后细胞的NF-κB活性降低,且联合用药组[(12.81±4.18)%和(9.08±2.66)%]抑制程度较5-Aza-dc组[(39.13±3.38)%、(34.90±4.89)%]和TSA组[(27.55±5.00)%、(22.11±3.07)%]更加明显(P<0.05)。结论 5-Aza-dC与TSA均可抑制胃癌细胞生长和促进细胞凋亡,逆转MGMT基因甲基化反应,提高基因表达和抑制NF-κB的活性,二药联合作用提示效果更加明显。

5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A对胃癌细胞生长抑制作用的研究

目的探讨5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A对胃癌细胞生长抑制作用。方法应用MTT比色法检测各组细胞增殖情况,应用金氏公式计算联合用药效果。结果单独及联合应用不同浓度的5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A作用MGC-803细胞不同时间,细胞生长抑制作用均随着药物浓度的增加和时间的延长逐渐增加,联合用药效果表现为相加作用(q>0.85)。结论单独应用5-氮-2-脱氧胞苷与曲古抑菌素A,细胞生长抑制率均明显增加;联合用药发挥相加作用,为临床联合用药提供了理论依据。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用

背景与目的:5-杂氮-2′-脱氧胞苷是DNA甲基转移酶抑制剂,能使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活,进而抑制肿瘤的生长。本文观察了5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用,探讨其抗肿瘤效应及可能的机理,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法:用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理人鼻咽癌细胞,观察其对细胞生长的抑制及死亡相关蛋白激酶基因(death-associated proteinkinase,DAPK)甲基化情况。建立人鼻咽癌移植瘤裸鼠模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况,并用RT-PCR和免疫组织化学技术检测DAPK基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:未经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理的CNE细胞中DAPKmRNA不表达。经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理后,不同药物浓度组的细胞中均有DAPKmRNA表达,且表达随浓度增高而增强。5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的生长均有明显的抑制作用,且能使失活的DAPK基因重新激活。药物作用4周后,用药组裸鼠体重(22.35±2.02)g与对照组(21.68±2.14)g之间无显著性差异(t=0.011,P>0.05),用药组肿瘤的体积(195.32±27.57)mm3较对照组(343.67±23.08)mm3明显减小,两者之间有显著性差异(t=10.11,P﹤0.01)。在鼻咽癌移植瘤中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用可能是因为其使因甲基化而失活的抑癌基因DAPK再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。

5-氮-2′-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞株A549增殖和凋亡的影响

目的探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人肺腺癌细胞株A549增殖和凋亡的影响。方法人肺腺癌细胞株A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。实验分4组,5-aza-dC组:细胞接种20h后,加入5μmol/L的5-aza-dC;TSA组:细胞接种20h后,加入300nmol/LTSA;5-aza-dC+TSA组:细胞接种20h后,加入5μmol/L5-aza-dC,24h后再加入300nmol/L TSA;对照组:DMEM培养液中加入等量的二甲基亚砜(DMSO)。MTT比色法测定各处理因素对A549细胞生长的影响;Annexin V/PI双染法测定各组细胞培养72h后的凋亡情况;应用RT-PCR检测各组细胞培养72h后细胞CCAAT增强子启动蛋白α(C/EBPα)mRNA的表达。结果 (1)5-aza-dC及TSA呈时间依赖性地抑制A549细胞的生长,而在同一时间不同组别比较联合用药组细胞生长抑制率较单用药组明显增加[12h:35.51%vs21.63%,19.59%;24h:43.19%vs32.39%,30.60%;36h:54.85%vs38.83%,37.35%;48h:60.69%vs45.79%,43.84%;60h:68.92%vs50.60%,50.20%;72h:74.54%vs59.23%,57.82,P<0.05];(2)5-aza-dC和TSA能够诱导A549细胞凋亡,且联合用药组A549细胞凋亡率(75.35±1.46)%明显高于5-aza-dC(49.76±1.32)%(P<0.05)和TSA组(50.88±1.06)%(P<0.05);(3)5-aza-dC和TSA能够上调C/EBPαmRNA的表达,联合用药组中C/EBPαmRNA表达量(0.581±0.024)明显高于5-aza-dC组(0.402±0.016)(P<0.05)和TSA组(0.394±0.031)(P<0.05),有统计学意义;(4)5-aza-dC组与TSA组在抑制A549细胞生长、诱导细胞凋亡、增强C/EBPαmRNA的表达方面比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。结论与单用5-aza-dC或TSA相比,联合应用两种药物能够更好的抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、诱导细胞凋亡和增强C/EBPα基因mRNA的表达。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨

目的:探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点。方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线。用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associatedproteinkinaseDAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P>0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P<0.01)。在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷抑制人鼻咽癌CNE细胞生长的机制

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)抑制人鼻咽癌CNE细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法用5-Aza-CdR处理人鼻咽癌CNE细胞,应用MTT试验观察不同浓度的5-Aza-CdR对癌细胞生长增殖的影响。用甲基化特异性PCR(MSP)分析死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因甲基化状态;逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA、蛋白的表达情况及细胞凋亡和细胞周期的变化。结果从CNE细胞生长曲线知各浓度的5-Aza-CdR对细胞生长均有抑制作用。未经5-Aza-CdR处理的CNE细胞中DAPK基因CpG岛过甲基化,且DAPK mRNA不表达。经5-Aza-CdR处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,用药组的细胞中均有DAPK mRNA表达,且表达随药物浓度增高而增强。免疫细胞化学结果显示,经药物处理后的CNE细胞中DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式细胞分析结果显示,药物处理后细胞凋亡率明显增加,且G0/G1期细胞增加,G2/M期减少。结论5-Aza-CdR对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因重新表达的结果。

DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对胃癌的影响

目的:研究DNA甲基化转移酶(DNMT)各亚型DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L在胃癌与胃黏膜中的表达特点,并分析DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌和胃黏膜细胞的影响。方法:免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织行5种DNMT表达研究。免疫荧光法和Western免疫印迹法对SGC-7901、MKN-45(胃癌细胞)和GES-1(胃黏膜细胞)行5种DNMT表达研究。噻唑蓝比色法和流式细胞术分析5-氮杂-2'-脱氧胞苷对SGC-7901、MKN-45和GES-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果:胃癌与癌旁组织均有5种DNMT不同程度表达,但胃癌组织DNMT1和DNMT3A表达显著低于癌旁组织(P<0.01),DNMT2和DNMT3L表达也低于癌旁组织(P<0.05),只有DNMT3B在胃癌与癌旁组织中无显著差异(P>0.05)。胃癌细胞(SGC-7901和MKN-45)与胃黏膜细胞(GES-1)亦有部分DNMT表达,除DNMT3B在胃黏膜细胞表达较强外,余DNMT在胃癌与胃黏膜细胞中无显著差异。5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌与胃黏膜细胞的增殖率、周期分布和凋亡率并无显著影响。结论:DNMT在胃癌中表达呈降低趋势,抑制DNMT对胃癌细胞的增殖和凋亡无显著影响。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导裸鼠HepG2种植瘤细胞T-cadherin的表达及其对种植瘤的抑制作用

目的:探讨去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)在裸鼠体内诱导HepG2细胞T-cadherin的表达,及其对HepG2种植瘤生长的抑制作用.方法:皮下接种法建立HepG2细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(11只)和对照组(10只).实验组裸鼠给予5-Aza-CdR注射,对照组裸鼠注射等量PBS.4wk后处死裸鼠,观察种植瘤的生长情况,用RT-PCR技术及免疫组织化学技术检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达.结果:用药4wk后,实验组肿瘤组织的T-cadherin mRNA的表达水平显著高于对照组(t=6.613,P<0.05);对照组HepG2细胞几乎检测不到T-cadherin蛋白表达,而实验组裸鼠种植瘤细胞膜上可检测到T-cadherin蛋白表达;实验组肿瘤的平均体积明显小于对照组肿瘤平均体积(t=2.337,P=0.025).结论:5-Aza-CdR能诱导裸鼠皮下种植HepG2瘤细胞的T-cadherin表达,抑制HepG2种植瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的T-cadherin启动子去甲基化,恢复T-cadherin的表达,从而抑制HepG2种植瘤生长.

5-氮杂-2’-脱氧胞苷抑制肾癌细胞增殖及逆转γ-catenin基因甲基化作用

目的:研究甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肾癌OS-RC-2细胞生长的抑制作用及对γ-catenin基因甲基化状态的影响,初步探讨肾癌发病机制及临床治疗的可行性。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理肾癌细胞OS-RC-2后,采用倒置显微镜观察5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株前后细胞形态学变化;四唑蓝(MTT)比色观察细胞经药物处理前后的生长活性;流式细胞仪检测5-Aza-CdR对OS-RC-2肾癌细胞株凋亡的影响;Western blot检测5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株后γ-catenin蛋白表达的变化;甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测细胞处理前后γ-catenin基因的甲基化状态。结果:形态学观察显示,用药后癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块;5-Aza-CdR明显抑制肾癌细胞OS-RC-2的生长;细胞凋亡率增高;药物处理后γ-catenin蛋白表达恢复;未经5-Aza-CdR处理的OS-RC-2细胞中γ-catenin基因启动子区域高甲基化,经10-5mol/L5-Aza-CdR处理72h后,γ-catenin基因启动子区域高甲基化得到逆转。结论:5-Aza-CdR能有效逆转肾癌OS-RC-2细胞γ-catenin基因的异常甲基化,恢复γ-catenin蛋白表达,诱导肾癌细胞凋亡。

5-杂氮-2’-脱氧胞苷抑制人喉癌细胞生长机制的研究

目的观察5-杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系生长增殖的影响,探讨其抗肿瘤效应及可能的机制。方法用5- 杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系处理后,甲基化特异性PCR(MSP),T-A克隆测序分析死亡相关蛋白激酶(death-associ- ated protein kinase,DAPK)基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA和蛋白的表达情况及细胞凋亡和周期的变化。结果未经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞中DAPK基因CpG岛甲基化,且 DAPK mRNA不表达。经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,大于或等于10-7 mol·L-1组的细胞中有DAPK mRNA表达,且表达随浓度增高而增强。免疫细胞化学染色显示,经处理后的肿瘤细胞DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式分析结果为处理后凋亡率明显增加,且G1期细胞增加,G2／M期减少。结论 5-杂氮-2’-脱氧胞苷能抑制喉癌细胞的生长和增殖,可能的机制是其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因的重新表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古霉素 A 对高糖诱导下胰岛 β 细胞的增殖及 PDX-1 甲基化的影响

目的：探讨高糖诱导下应用5-氮杂-2~′-脱氧胞苷（5-Aza-d C）和曲古霉素A（TSA）对胰岛β细胞NIT-1细胞株增殖及PDX-1启动子区甲基化及其表达的影响。方法：胰岛β细胞株予33.3 mmol/L葡萄糖浓度处理后随机分为：空白对照（NC）组、高糖诱导（HG）组、5-Aza-d C干预组、TSA干预组、5-Aza-d C＋TSA联合干预组,检测细胞增殖情况、胰岛素释放水平、PDX-1启动子区甲基化状态及其表达水平的变化。结果：5-Aza-d C和TSA单独或联合干预可增加NIT-1细胞增殖率和胰岛素分泌量,降低PDX-1启动子区甲基化产物,增加PDX-1 m RNA相对表达量,并且联合组比单药组效果更加明显（均P〈0.05）。结论：5-Aza-d C和TSA可以激活高糖诱导下失表达的PDX-1,进而恢复胰岛β细胞功能,两药联合具有协同效应。