5-氮杂-2’-脱氧胞苷对苯并[a]芘致海马神经元毒性的保护作用

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)对苯并[a]芘(B[a]P)致海马神经元毒性的保护作用。方法体外培养海马神经元至第5天,观察并鉴定细胞。实验设立对照组,B[a]P组(20μmol/L B[a]P)和B[a]P+5-Aza-cdR组(20μmol/L B[a]P+10μmol/L 5-Aza-cdR)。观察细胞形态;检测细胞活力、DNA甲基转移酶蛋白和基因表达水平;测定细胞中的总甲基化水平和细胞凋亡情况。结果与对照组比较,B[a]P组海马神经元活性降低(P<0.05);细胞凋亡率升高(P<0.05);DNMT3A、DNMT3B基因和DNMT1、DNMT3A蛋白表达水平上升(P<0.05);总甲基化水平升高(P<0.05)。与B[a]P组比较,B[a]P+5-Aza-cdR组提高了海马神经元活性(P<0.05);降低细胞凋亡率(P<0.01);DNMTs基因和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);总甲基化水平下降(P<0.01)。结论5-Aza-cdR对B[a]P诱导的海马神经元损伤有保护作用。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用

背景与目的:5-杂氮-2′-脱氧胞苷是DNA甲基转移酶抑制剂,能使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活,进而抑制肿瘤的生长。本文观察了5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用,探讨其抗肿瘤效应及可能的机理,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法:用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理人鼻咽癌细胞,观察其对细胞生长的抑制及死亡相关蛋白激酶基因(death-associated proteinkinase,DAPK)甲基化情况。建立人鼻咽癌移植瘤裸鼠模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况,并用RT-PCR和免疫组织化学技术检测DAPK基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:未经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理的CNE细胞中DAPKmRNA不表达。经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理后,不同药物浓度组的细胞中均有DAPKmRNA表达,且表达随浓度增高而增强。5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的生长均有明显的抑制作用,且能使失活的DAPK基因重新激活。药物作用4周后,用药组裸鼠体重(22.35±2.02)g与对照组(21.68±2.14)g之间无显著性差异(t=0.011,P>0.05),用药组肿瘤的体积(195.32±27.57)mm3较对照组(343.67±23.08)mm3明显减小,两者之间有显著性差异(t=10.11,P﹤0.01)。在鼻咽癌移植瘤中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用可能是因为其使因甲基化而失活的抑癌基因DAPK再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷抗白血病作用的体外研究

目的:研究甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞株HL-60生长、分化、凋亡的影响,初步探讨其抗白血病作用的可能机制。方法:不同浓度和时间的5-aza-2dC处理HL-60细胞后,采用MTT比色试验检测5-aza-2dC对HL-60细胞生长的影响;采用流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞周期及分化的影响;采用Hochest33342染色和流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞凋亡的影响;采用RT-PCR法检测药物处理对S100A8和S100A9基因mRNA表达水平的影响。结果:(1)5-aza-2dC呈剂量和时间依赖性地抑制HL-60细胞的生长,并使HL-60细胞周期阻滞于G2/M期;(2)5-aza-2dC处理使HL-60细胞的髓系分化抗原CD11b的表达增强,在低浓度(0.5μmol/L)时其促分化作用最明显;(3)5-aza-2dC呈剂量和时间依赖性地诱导HL-60细胞凋亡,在高浓度(5.0μmol/L)时诱导凋亡的作用最明显;(4)5-aza-2dC能明显上调S100A8和S100A9基因mRNA的表达。结论:5-aza-2dC能抑制HL-60细胞生长,阻滞HL-60细胞于G2/M期,促进HL-60细胞分化和诱导其凋亡,并能上调S100A8和S100A9基因的表达,这些作用可能是5-aza-2dC抗急性髓系白血病的重要机制。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞。hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受。本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂—5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'——deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用。方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化。MTT法检测药物对细胞增殖的影响。结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化。单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显。COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达。TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05)。联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05)。5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05)。结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。

5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌SGC-7901细胞生长及CHFR基因表达水平的影响

背景与目的:抑癌基因甲基化具有可逆性,相关药物可逆转甲基化使失活的基因重新表达。本研究观察去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞活性及CHFR基因mRNA和蛋白表达水平的影响。方法:使用不同浓度的5-Aza-dC和(或)TSA处理SGC-7901细胞,分为对照组、TSA组(250 nmol/L)、5-Aza-dC组(5μmol/L)及TSA(250 nmol/L)联合5-Aza-dC(5μmol/L)组等4个组,采用台盼蓝染色法检测细胞活性,并利用RT-PCR及蛋白质印迹法(Westernblot)方法检测CHFR基因mRNA和蛋白表达的水平。结果:5-Aza-dC和TSA作用24、48、60和72 h后SGC-7901细胞活性均被抑制,且抑制率呈浓度和时间依赖性,两药联合作用更明显;SGC-7901细胞经5-Aza-dC单独或与TSA联合干预后,能提高CHFR基因mRNA和蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5-Aza-dC和(或)TSA均能抑制细胞活性,提高CHFR基因mRNA和蛋白表达水平,两药联合的效果比单药明显增加,为临床胃癌患者的化疗方案提供了实验依据。

5杂-氮-2′-脱氧胞苷对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响

目的观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响;探讨14-3-3σ基因甲基化与顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞耐药的关系。方法建立人胃癌顺铂耐药细胞株SGC-7901/CDDP,并用特异性甲基化抑制物5-Aza-CdR干预。MSP法检测14-3-3σ基因甲基化状态,蛋白质印迹法检测14-3-3σ蛋白表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期与凋亡。结果 SGC-7901/CDDP细胞的14-3-3σ基因高度甲基化并沉默,经过5、10μmol.L-15-Aza-CdR处理后,14-3-3σ蛋白重新表达,细胞发生顺铂耐药逆转,细胞活性抑制、在G0/G1期出现阻滞以及凋亡率明显增加。结论 5-Aza-CdR具有抑制顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的作用,同时,顺铂作用与耐药机制部分依赖于14-3-3σ基因。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷调控HOXA10对子宫内膜异位症患者在位内膜容受性的影响

目的:研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,AZA)对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜容受性的影响。方法:体外原代培养内异症子宫内膜上皮细胞,AZA作用24h后,亚硫酸氢盐测序法(BisulfiteSequencing)检测HOXA10的甲基化水平的变化;实时定量PCR和Western Blot方法检测HOXA的转录和蛋白水平的变化。结果:AZA作用24h后,子宫内膜上皮细胞HOXA10的甲基化水平下降;同时HOXA10的表达增加。结论:AZA可通过抑制内异症子宫内膜上皮细胞中HOXA10的高甲基化,上调HOXA10的表达,从而促进子宫内膜容受性的建立。

5-杂氮脱氧胞苷逆转膀胱癌T24细胞死亡相关蛋白激酶的转录表达

目的研究膀胱癌细胞T24中死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子区的甲基化状态,探讨使用5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)处理T24细胞后对DAPK转录表达的影响及其细胞生物学效应。方法使用不同浓度去甲基化药物5-aza-dc处理膀胱癌细胞株T24后,使用MTT法、流式细胞仪分别检测5-aza-dc对T24细胞的增殖抑制作用及凋亡率。应用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK启动子区甲基化状态的变化情况。应用RT-PCR、Western-blotting分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK转录、表达的变化情况。结果MTT法显示不同浓度5-aza-dc对T24细胞有明显的增殖抑制作用,流式细胞仪检测T24细胞的最大凋亡率为(24.12±1.4)%。正常培养条件下T24细胞中DAPK启动子区出现高甲基化且DAPKmRNA无表达,在5-aza-dc(12.5μmol/L)作用24h后,T24细胞中DAPK启动子区恢复为未甲基化状态且DAPKmRNA及蛋白重新恢复表达。结论膀胱癌细胞株T24中DAPK启动子区高甲基化可能是抑制其转录表达的重要原因;5-aza-dc可以通过去甲基化作用使DAPK恢复表达,从而抑制T24细胞的增殖并诱导细胞凋亡。5-aza-dc有望成为膀胱癌化疗的有效药物。

5-氮杂脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2中抑癌基因FHIT表达的影响

背景与目的:肝癌细胞中由于FHIT基因过度甲基化而导致其表达降低。本实验应用甲基化酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)作用肝癌细胞株HepG2,观察用药后肝癌细胞中FHIT mRNA和蛋白表达的变化,并观察5-Aza-dC对细胞增殖的影响。方法:以5-Aza-dC作用HepG2细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)检测HepG2细胞中FHIT甲基化变化;采用RT-PCR检测FHIT mRNA的表达;采用细胞免疫组织化学染色和Western blot方法检测FHIT蛋白表达,MTT法检测HepG2细胞增殖情况。结果:5-Aza-dC处理前,HepG2细胞FHIT基因呈甲基化状态,mRNA及蛋白表达缺失;经5-Aza-dC作用后,MSP显示HepG2细胞FHIT基因甲基化逆转;经1.0μmol/L、2.0μmol/L及4.0μmol/L的5-Aza-dC作用48h后,FHIT基因mRNA扩增出产物的吸光度值分别为0.80±0.32、1.41±0.54和1.51±0.61,Western blot检测产物积分灰度值分别为0.33±0.20、1.00±0.26和1.12±0.38;当药物浓度达到1.0μmol/L时出现了对HepG2细胞增殖的抑制作用。结论:5-Aza-dC能明显逆转HepG2细胞的FHIT基因异常甲基化,激活因高甲基化所致基因沉默的再转录,诱导该基因的表达;同时抑制细胞增殖。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性。方法用浓度为50μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况。RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mR-NA和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对腺样囊性癌细胞RECK基因表达及细胞侵袭力的影响

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine,5-aza-d C)对腺样囊性癌细胞中RECK基因表达及肿瘤侵袭力的影响。方法:采用甲基化特异性PCR、实时定量PCR、Western印记检测腺样囊性癌细胞中RECK基因的甲基化状态及RECK基因mRNA和蛋白的表达,transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果:RECK基因甲基化条带仅在ACC-M细胞中发现,经5-aza-d C处理后ACC-M细胞中RECK基因甲基化得到逆转,RECK基因mRNA及蛋白的表达显著提升。ACC-M细胞的侵袭力明显降低。结论:5-aza-d C可逆转腺样囊性癌ACC-M细胞中RECK基因的高甲基化状态并恢复RECK基因mRNA及蛋白的表达,抑制ACC-M细胞侵袭力。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨

目的:探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点。方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线。用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associatedproteinkinaseDAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P>0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P<0.01)。在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷抑制人鼻咽癌CNE细胞生长的机制

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)抑制人鼻咽癌CNE细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法用5-Aza-CdR处理人鼻咽癌CNE细胞,应用MTT试验观察不同浓度的5-Aza-CdR对癌细胞生长增殖的影响。用甲基化特异性PCR(MSP)分析死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因甲基化状态;逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA、蛋白的表达情况及细胞凋亡和细胞周期的变化。结果从CNE细胞生长曲线知各浓度的5-Aza-CdR对细胞生长均有抑制作用。未经5-Aza-CdR处理的CNE细胞中DAPK基因CpG岛过甲基化,且DAPK mRNA不表达。经5-Aza-CdR处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,用药组的细胞中均有DAPK mRNA表达,且表达随药物浓度增高而增强。免疫细胞化学结果显示,经药物处理后的CNE细胞中DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式细胞分析结果显示,药物处理后细胞凋亡率明显增加,且G0/G1期细胞增加,G2/M期减少。结论5-Aza-CdR对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因重新表达的结果。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导裸鼠HepG2种植瘤细胞T-cadherin的表达及其对种植瘤的抑制作用

目的:探讨去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)在裸鼠体内诱导HepG2细胞T-cadherin的表达,及其对HepG2种植瘤生长的抑制作用.方法:皮下接种法建立HepG2细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(11只)和对照组(10只).实验组裸鼠给予5-Aza-CdR注射,对照组裸鼠注射等量PBS.4wk后处死裸鼠,观察种植瘤的生长情况,用RT-PCR技术及免疫组织化学技术检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达.结果:用药4wk后,实验组肿瘤组织的T-cadherin mRNA的表达水平显著高于对照组(t=6.613,P<0.05);对照组HepG2细胞几乎检测不到T-cadherin蛋白表达,而实验组裸鼠种植瘤细胞膜上可检测到T-cadherin蛋白表达;实验组肿瘤的平均体积明显小于对照组肿瘤平均体积(t=2.337,P=0.025).结论:5-Aza-CdR能诱导裸鼠皮下种植HepG2瘤细胞的T-cadherin表达,抑制HepG2种植瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的T-cadherin启动子去甲基化,恢复T-cadherin的表达,从而抑制HepG2种植瘤生长.

DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对胃癌的影响

目的:研究DNA甲基化转移酶(DNMT)各亚型DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L在胃癌与胃黏膜中的表达特点,并分析DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌和胃黏膜细胞的影响。方法:免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织行5种DNMT表达研究。免疫荧光法和Western免疫印迹法对SGC-7901、MKN-45(胃癌细胞)和GES-1(胃黏膜细胞)行5种DNMT表达研究。噻唑蓝比色法和流式细胞术分析5-氮杂-2'-脱氧胞苷对SGC-7901、MKN-45和GES-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果:胃癌与癌旁组织均有5种DNMT不同程度表达,但胃癌组织DNMT1和DNMT3A表达显著低于癌旁组织(P<0.01),DNMT2和DNMT3L表达也低于癌旁组织(P<0.05),只有DNMT3B在胃癌与癌旁组织中无显著差异(P>0.05)。胃癌细胞(SGC-7901和MKN-45)与胃黏膜细胞(GES-1)亦有部分DNMT表达,除DNMT3B在胃黏膜细胞表达较强外,余DNMT在胃癌与胃黏膜细胞中无显著差异。5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胃癌与胃黏膜细胞的增殖率、周期分布和凋亡率并无显著影响。结论:DNMT在胃癌中表达呈降低趋势,抑制DNMT对胃癌细胞的增殖和凋亡无显著影响。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷抑制肾癌细胞增殖及逆转γ-catenin基因甲基化作用

目的:研究甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肾癌OS-RC-2细胞生长的抑制作用及对γ-catenin基因甲基化状态的影响,初步探讨肾癌发病机制及临床治疗的可行性。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理肾癌细胞OS-RC-2后,采用倒置显微镜观察5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株前后细胞形态学变化;四唑蓝(MTT)比色观察细胞经药物处理前后的生长活性;流式细胞仪检测5-Aza-CdR对OS-RC-2肾癌细胞株凋亡的影响;Western blot检测5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株后γ-catenin蛋白表达的变化;甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测细胞处理前后γ-catenin基因的甲基化状态。结果:形态学观察显示,用药后癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块;5-Aza-CdR明显抑制肾癌细胞OS-RC-2的生长;细胞凋亡率增高;药物处理后γ-catenin蛋白表达恢复;未经5-Aza-CdR处理的OS-RC-2细胞中γ-catenin基因启动子区域高甲基化,经10-5mol/L5-Aza-CdR处理72h后,γ-catenin基因启动子区域高甲基化得到逆转。结论:5-Aza-CdR能有效逆转肾癌OS-RC-2细胞γ-catenin基因的异常甲基化,恢复γ-catenin蛋白表达,诱导肾癌细胞凋亡。

5-杂氮-2’-脱氧胞苷抑制人喉癌细胞生长机制的研究

目的观察5-杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系生长增殖的影响,探讨其抗肿瘤效应及可能的机制。方法用5- 杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系处理后,甲基化特异性PCR(MSP),T-A克隆测序分析死亡相关蛋白激酶(death-associ- ated protein kinase,DAPK)基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA和蛋白的表达情况及细胞凋亡和周期的变化。结果未经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞中DAPK基因CpG岛甲基化,且 DAPK mRNA不表达。经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,大于或等于10-7 mol·L-1组的细胞中有DAPK mRNA表达,且表达随浓度增高而增强。免疫细胞化学染色显示,经处理后的肿瘤细胞DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式分析结果为处理后凋亡率明显增加,且G1期细胞增加,G2／M期减少。结论 5-杂氮-2’-脱氧胞苷能抑制喉癌细胞的生长和增殖,可能的机制是其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因的重新表达。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人肝癌细胞株SMMC7721增殖及DAPK mRNA表达的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC7721细胞增殖以及对死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase,DAPK)基因mRNA表达水平的影响。方法:用不同浓度(0.5,5.0,50.0μmol/L)的5-Aza-CdR对SMMC7721细胞处理后,采用MTT法检测细胞的增殖情况;半定量RT-PCR法检测各组细胞DAPK mRNA的表达水平。结果:5-Aza-CdR对肝癌细胞株SMMC7721生长有明显抑制作用,并且存在剂量依赖性反应关系(F=242.40,P<0.01);半定量RT-PCR结果显示,MMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平很弱,采用不同浓度5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞72h后,SMMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平呈剂量依赖性逐渐升高(F=360.41,P<0.01)。结论:5-Aza-CdR可诱导MMC7721细胞DAPK mRNA表达,并抑制SMMC7721细胞增殖。

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-CdR)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用0.5、1.0、1.5μmol/L浓度的5'-Aza-CdR处理CRC细胞株HT-29和LoVo。应用MethyLight方法、实时荧光定量PCR方法及蛋白印迹试验(Westernblot)检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中MGMT基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达情况。结果 MethyLight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转。实时荧光定量PCR检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组HT-29细胞株和LoVo细胞株MGMT基因mRNA表达水平均较对照组上调,Western blot检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组MGMT蛋白表达水平均较对照组上调,且均具有药物剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论 CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能够逆转CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对T47D乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨去甲基化5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对T47D乳腺癌细胞株生长周期及凋亡的影响。方法分别使用浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、25.0、100.0μmol/L 5-Aza-CdR处理T47D细胞株。MTT法检测T47D细胞存活率。流式细胞仪检测T47D细胞生长周期,观察细胞凋亡情况。RT-PCR法检测处理前后抑癌基因p16 mR-NA表达。结果5-Aza-CdR作用后T47D细胞明显受抑,G0/G1期细胞明显增多,细胞阻滞于G1期,凋亡率明显增高;5-Aza-CdR处理后无p16表达的T47D细胞检测出p16基因的重新表达。结论5-Aza-CdR可抑制T47D细胞的生长,并促进其凋亡;其机制可能为消除某些抑癌基因启动子甲基化。