影响5-溴脱氧尿苷杀伤油菜种子的几个因素分析

用５－溴脱氧苷（ＢＵｄＲ）处理甘蓝型油菜中油８２１种子，结果表明，ＢＵｄＲ能有效地杀伤油菜种子。在２８℃条件下，用浓度为０．９７３ｍｇ／ｍｌ处理露白的种子，其死亡率可达１０％。

5—溴脱氧尿苷标记检测细胞增殖活性方法的建立和应用

目前，用５－溴脱氧尿苷标记法检测细胞增殖活性国内尚未见报道，据此，本实验室结合研究课题需要，建立了５－溴脱氧尿苷标记检测细胞增殖活性的免疫细胞化学方法，探讨了测定细胞增殖活性的几种主要影响因素，并在此基础上用于检测Ｓ期肥大细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３成纤维细胞，获得满意结果，作者认为，与其它检测细胞增殖活性的方法，如＾３Ｈ－ＴｄＲ渗入法比较，５－溴脱氧尿苷标记法简便快速可靠，值得在实验室和临床推广使用。

差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。

荧光素标记5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷合成及荧光光谱研究

由5-溴-2′-脱氧尿苷通过1,2,4-三唑和硫代乙酸在温和的条件下合成4-硫-5-溴-2′-脱氧尿苷,再通过单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)对5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷4位硫的亲电反应,合成了用单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)标记的5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷,并利用1HNMR核磁共振、质谱和紫外光谱对它们的结构进行了表征,并对它的荧光光谱进行分析和研究.此化合物可以产生极高的荧光特性,由此提供了一条对人体中5-4-硫-2′-脱氧尿苷的检测途径.

(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)尿苷/脱氧尿苷的合成及细胞毒性评价

以尿苷(1a)或2'-脱氧尿苷(1b)类化合物为原料,经碘代、选择性氧化、Heck反应等步骤快捷、环保地合成(E)-5-(2-溴乙烯基)尿苷/(E)-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿苷(5a/5b),再通过酯化、硫羰基化、氨解等步骤合成新化合物(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)尿苷/(E)-4-硫-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿苷(8a/8b),共得到5种新的硫代产物,其中包含2种新产物8a/8b,3种新中间体7a,7b,10.其结构通过~1H NMR,^(13)C NMR,IR,UV,HRMS,X-Ray等谱图手段进行了表征.采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)实验方法对8a及其类似物进行了细胞毒性评价,发现8a/8b是潜在的抗肿瘤药物.

BrdU-ELISA法测定四逆汤及组方药提取物对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察四逆汤 (SNT)及组方药提取物对大鼠主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。方法采用 MTT比色法和 Brd U- EL ISA法观察药物对离体大鼠 VSMC增殖的影响。结果 Brd U- EL ISA法结果表明四逆汤总提取物 (EST)对 VSMC的 Brd U掺入 DNA没有显著影响 ,而 MTT测定表明 EST可以提高 VSMC的脱氢酶活性。甘草 (L E)、附子 (AE)、干姜 (GE)、甘草加附子 (L AE)、干姜加附子 (AGE)提取物显著提高VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。结论 EST可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,但对 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平无影响。而其他组方药提取物可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。

低剂量脉冲超声波对培养细胞增殖作用

目的研究不同条件低剂量脉冲超声波刺激体外培养人皮肤成纤维细胞的增殖情况。方法采用5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法测定成纤维细胞增殖情况。结果在BrdU掺入法测定中,细胞培养液不含小牛血清(FCS)时,超声波刺激时间为8和14 min剂量组的BrdU阳性着色细胞率与对照组比较有显著性增高(P<0.05,P<0.01);而细胞培养液含10%FCS时,超声波刺激时间为5,8,11和14 min剂量组的BrdU阳性着色细胞率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。且培养液的FCS含量分别为0%,5%和10%时,BrdU阳性着色细胞率的高峰值均在低剂量脉冲超声波刺激时间为8～11 min时。结论在一定刺激时间内,低剂量脉冲超声波能促进人皮肤成纤维细胞增殖,其增殖情况与超声波的刺激时间以及细胞培养液中是否含有小牛血清有关。

强制运动促进成年大鼠海马齿状回神经发生并提高学习能力(英文)

为了探讨强制运动对成年大鼠海马齿状回(dentategyrus,DG)神经发生的影响,强制大鼠在马达驱动的转轮中跑步,用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记增殖细胞,巢蛋白(neuroepthelialstemcellprotein,nestin)标记神经干细胞/前体细胞,然后用免疫细胞化学技术检测大鼠DG中BrdU及nestin阳性细胞。为了解强制运动后DG增殖细胞的功能意义,采用Y-迷宫检测大鼠的学习能力。结果表明,强制运动组DG中BrdU及nestin阳性细胞数均明显多于对照组(P<0.05);强制运动对DG神经发生的效应有强度依赖性。Y-迷宫检测结果显示,强制运动能明显改善大鼠的学习能力。结果提示,在转轮中进行强制跑步能促进成年大鼠DG的神经发生,并改善学习能力。

乌灵胶囊增加慢性不可预见性温和应激大鼠海马连接蛋白43的表达改善神经再生(英文)

目的:探讨乌灵胶囊对慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress , CMS)抑郁模型大鼠海马齿状回脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor , BDNF)、神经再生,以及连接蛋白43(connexin 43 ,Cx43)表达的影响。方法:45只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入对照组(n=15)、模型组(n=15)和乌灵胶囊组(n=15)。模型组和乌灵胶囊组大鼠接受连续3周的CMS,造模期间,乌灵胶囊按100 mg/(kg.d)加入乌灵胶囊组大鼠的膳食中,连续治疗21 d。采用糖水偏爱实验评价大鼠的抑郁程度。抑郁行为测试结束后,取双侧海马组织,用免疫组织化学法检测BDNF与5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine ,BrdU)的表达;用逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹法检测海马中Cx43 mRNA与蛋白表达。结果:慢性应激大鼠齿状回BDNF阳性表达、新生细胞数及Cx43 mRNA和蛋白表达水平均较正常大鼠明显下降。乌灵胶囊治疗后,CMS大鼠抑郁行为得到改善,异常的海马神经再生恢复,Cx43 mRNA和蛋白表达变得正常,但BDNF表达无明显改变。结论:乌灵胶囊可增加CMS模型大鼠海马神经再生及改善抑郁症状,其机制可能与增加Cx43表达有关,与BDNF无关。

局灶性脑缺血再灌注大鼠Nestin的表达

目的了解局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中Nestin的表达特点。方法采用改良的线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)2h后不同再灌注时间段(6h、12h、24h、72h、7d、14d)的大鼠局灶性脑缺血模型,应用免疫组织化学技术检测Nestin的表达。结果脑缺血再灌注后6h,Nestin+表达即有增加,至3d时Nestin+表达显著增强,Brdu+/Nestin+细胞也已明显可见,至7d时Nestin+表达、Brdu+/Nestin+细胞数目均达顶峰,至再灌注14dNestin+表达及Brdu+/Nestin+细胞数目均已明显回落。结论脑缺血可引发大鼠Nestin的表达上调,并可诱导神经干细胞增殖。

大鼠脑梗死后内源性神经干细胞的增殖及迁移

目的研究成年大鼠脑梗死后内源性神经干细胞增殖及迁移。 方法制作大鼠脑梗死模型,将其分成梗死后1、3、7、14、28 d组,对照组为假手术组。免疫组织化学方法动态检测大鼠脑内5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU)、巢蛋白(Nestin)的表达。 结果与正常对照组相比,室下区及海马BrdU和Nestin阳性细胞在脑梗死后1 d开始增加(P<0.05),7d达到高峰,14 d后开始下降,但仍高于正常水平(P<0.05),28 d后接近正常水平;室下区及海马BrdU和Nestin阳性细胞经胼胝体向对侧迁移。 结论脑梗死可激活内源性神经干细胞原位增殖及迁移。

实验性哮喘气道细胞DNA合成和气道重塑研究

【目的】 观察重复过敏原吸入刺激致敏的大鼠气道细胞DNA合成和气道壁结构的改变 ,并探讨气道重塑反应发生的机制。 【方法】 应用SD大鼠建立哮喘模型 ,采用双标免疫组化技术和计算机图像分析系统对气道细胞的DNA合成和气道重塑进行研究。 【结果】 ①模型组气道平滑肌细胞和上皮细胞的DNA合成Brdu阳性计数明显高于正常对照组 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 ) ;②模型组气道平滑肌细胞和上皮细胞DNA合成Brdu阳性计数和气道直径呈高度正相关 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 ) ,正常对照组无明显相关性 (P >0 .0 1,P >0 .0 5 ) ;③模型组上皮层厚度明显大于正常对照组 (P <0 .0 1) ,平滑肌层厚度、气道直径和α 平滑肌肌动蛋白阳性区面积和正常对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 【结论】 变态反应性炎症所致的微环境改变可以导致气道细胞DNA合成增加以及细胞增生 。

头针对急性脑缺血再灌注大鼠BrdU/nestin表达的实验研究

目的观察头针对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠BrdU/nestin表达的影响,探讨头针治疗脑缺血的可能机制。方法将90只健康雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和头针组,各组再根据缺血再灌注时间的不同,随机分为7d、14d、28d共9个亚组。采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型,选取顶颞后斜线、顶颞前斜线,进针后接韩氏穴位神经刺激仪,每天治疗1次。对大鼠应用神经功能缺损评分(NSS),免疫荧光检测法观察脑缺血再灌注各时间点大鼠海马齿状回BrdU及BrdU/nestin含量。结果头针组与模型组各时相NSS组间比较,头针组显著低于模型组(P<0.05,P<0.01)。脑缺血再灌注侧海马齿状回BrdU的表达:模型组与假手术组比较均有显著性差异(P<0.01),头针组在各时间点上与模型组比较,均显著性升高(P<0.01),7 d达到峰值,14 d开始下降。脑缺血再灌注侧海马齿状回BrdU/nestin的表达:模型组与假手术组比较均有显著性差异(P<0.01),头针组在各时间点上与模型组比较,均显著性升高(P<0.05),以7 d最为明显(P<0.01)。结论头针可明显改善大鼠神经功能缺损状态,促进神经干细胞得再生,通过增加nestin的含量来促进急性脑缺血再灌注损伤过程中神经干细胞的修复,实现对缺血脑组织保护的目的。

基因体外诱变的一种新方法

在PCR的过程中 ,采用 5 溴脱氧尿苷三磷酸 (BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸 (dTTP)的方法 ,对克隆的野油菜黄单胞菌的α 淀粉酶基因进行了体外诱变。结果表明 ,BrdUTP浓度越高 ,诱变越强 ;浓度越低 ,诱变越弱。当BrdUTP浓度为dTTP的 0 1 %时 ,可以得到最多的正诱变结果。用LBSP鉴别培养基初筛 ,然后用Yoo改良法测定酶活 ,仅一轮诱变就获得了其表达产物α 淀粉酶的酶活分别降低了 5倍和提高了 2 0倍的两个突变基因。再以后者为PCR模板进行第二轮诱变 ,从而筛选到了α 淀粉酶的酶活提高 4 0倍的突变体。此诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题 。

内源性noggin对学习记忆过程中海马神经发生的调控作用

目的:探讨noggin对成年大鼠海马5溴-2脱氧尿苷(BrdU)表达与学习记忆相关性及长时程增强(longtermpotentiation,LTP)的影响。方法:侧脑室注射noggin反义寡核苷酸,BrdU标记结合免疫组化检测成年海马神经干细胞的增殖,刺激海马CA3区Schaffer侧支,在CA1锥体细胞层记录LTP。结果:侧脑室注射noggin反义寡核苷酸后,能明显抑制学习训练引起的海马齿回与颗粒细胞层BrdU免疫反应阳性细胞的增多效应,使齿回及颗粒细胞层BrdU阳性细胞数减少44.51%(t=82.57,P<0.01)和40.04%(t=68.54,P<0.01)。LTP结果显示noggin反义寡核苷酸明显抑制LTP的诱出率,并使群集性峰电位(populationspike,PS)的增幅与场兴奋性突触后电位(fieldexcitatorypostsynapticpotential,fEPSP)斜率增加的百分率均较对照组显著减低(P<0.01)。结论:提示内源性noggin参与调控学习记忆过程中海马的神经发生。

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法

目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法。方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况。结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞。Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%。在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布。结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法。

哮喘大鼠气道细胞DNA合成和气道重塑关系的实验研究

目的研究哮喘动物气道细胞的DNA合成和气道重塑以及二者之间的关系。方法建立大鼠哮喘模型,采用双标免疫组化技术和计算机图像分析系统对气道细胞的DNA合成和气道重塑进行研究。结果 （1）哮喘组气道平滑肌细胞和上皮细胞的DNA合成BrdU阳性计数明显高于对照组（P<0.01,P<0.05）;（2）哮喘组气道平滑肌细胞和上皮细胞DNA合成Brdu阳性计数和气道直径呈高度正相关（P<0.01,P<0.05）,对照组无明显相关性（P<0.05,P<0.05）;（3）哮喘组气道上皮层厚度明显大于对照组（P<0.01）,平滑肌层厚度、气道直径和α-平滑肌肌动蛋白阳性区面积和对照组无显著性差异（P>0.05）。结论变态反应性炎症所导致的气道细胞DNA合成增加以及细胞增生,可能是引起气道重塑反应发生的重要原因。

鼠骨髓间充质干细胞同种异体关节内和静脉内的移植研究

目的:研究鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)同种异体膝关节内移植,静脉移植后在膝关节内的存活与分布情况,为BMSCs在软骨损伤治疗中应用提供理论基础。方法:采用全骨髓培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用5-溴-2-脱氧尿苷标记细胞,计算标记阳性率,通过关节腔注射或鼠尾静脉植入大鼠体内,免疫组化观察术后2 w、4 w标记细胞存活、分布,HE染色观察植入后组织的免疫反应。结果:培养48 h后,BMSCs贴壁大部分呈长梭形,个别为多角形,7 d后细胞融合达90%以上。细胞生长曲线显示细胞生长潜伏期较长,接种后第3~6 d进入对数生长期,第7 d后进入平台期,传代后细胞在24 h内贴壁,以均一的长梭形为主,且生长增殖速度比原代快。标记的BMSCs呈绿色,经计数标记率为95%。同种异体BMSCs植入后均表现出较强的迁移能力,进入关节软骨内。随时间延长,关节软骨内的标记细胞逐渐增多,在异体关节软骨中至少可以存活4 w,关节腔注射和鼠尾静脉植入BMSCs均未观察到明显的免疫反应,且两组在植入2 w和4 w后Brdu标记阳性的BMSCs表达差异无统计学意义(P 0.05)。结论:异体BMSCs通过关节内注射和静脉移植对于治疗关节软骨损伤均具有一定的临床应用价值。

电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠侧脑室下区原位神经干细胞增殖的影响

目的：近来的研究认为，针刺任咏治疗脑卒中的机制在于针刺任脉可能产生与干细胞增殖分化有一些联系的生长因子。脑缺血损伤后调动内源性神经干细胞试图自我修复的途径应是多元化的，针刺及外源性生成因子的给予为其不同的途径。实验拟观察电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠缺血侧脑室下区5-溴-2＇-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷／巢蛋白阳性细胞的表达的影响。方法：实验于2004-09／2005-07在中山大学医学院解剖学实验室完成。①材料：选用成年健康雄性Wistar大鼠83只。将实验动物按随机抽签法分为5组：空白对照组6只、假手术组6只、模型组26只、电针任脉组23只、碱性成纤维细胞生长因子组22只。后3组又分为缺血后7，14和28d3个时间点进行观察。②干预：除空白对照组和假手术组外，其余大鼠采用线栓法制作局灶性脑缺血模型。再灌注后参考Longa神经病学评分标准，1～4分为造模成功。空白对照组不作任何处理：假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉，不予栓塞。电针任脉组大鼠于造模后第2天采用上海华谊医用仪器厂生产的G6805Ⅱ型电针仪针刺承浆、气海、关元3穴，针刺后加电，疏密波刺激（疏波30Hz，密波100Hz），强度6～15V，以身体相应部位出现轻微颤动为准，持续时间为20min。碱性成纤维细胞生长因子组：再灌后立即给药，肌注碱性成纤维细胞生长因子4000U／d．此后每天肌注碱性成纤维细胞生长因子，1次/d。模型组、假手术组大鼠于造模后第2天固定于针刺操作台上20min，不予针刺。空白对照组大鼠不作任何处理。③观察指标：通过免疫荧光方法测定侧脑室下区5-溴-2’-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷／巢蛋白阳性细胞的表达。用Olympus FV500激光共聚焦显微镜系统，在200倍镜下，计数平均5个视野阳性细胞数。结果：造模成功大鼠54只及空白对照组和模型组各6只进入结果分析。侧脑室5-溴-2＇-脱氧尿苷阳性细胞数和5-溴-2＇-脱氧尿苷／巢蛋白双标细胞：空白对照组与假手术组比较，差异无显著性意义（P〉0.05）。模型组与空白对照组相比，均有不同程度的增加，其中造模后7和14d差异有显著性意义（P〈0．01）。电针任脉组和碱性成纤维细胞生长因子组造摸后3个时间点与模型组比较，均有较大程度的增加，差异有显著性意义（P〈0．05～0.01）。碱性成纤维细胞生长因子组与电针任脉组相比，差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子均可促进局灶性缺血模型大鼠原位神经干细胞增殖，且两者作用相当。