色氨酸羟化酶2理性设计提高大肠埃希菌5-羟基色氨酸产量

色氨酸羟化酶(TPH)可催化色氨酸羟化为5-羟基色氨酸(5-HTP),是5-HTP生物合成过程中的关键酶。为了提高大肠埃希菌细胞工厂合成5-HTP的效率,通过酶的理性设计和定点突变技术构建了人色氨酸羟化酶2(TPH2)的系列突变体,并在高产L-色氨酸且含有TPH辅酶四氢生物蝶呤(BH_(4))合成与再生模块的大肠埃希菌中表达。发现适当降低酶和色氨酸、酶和BH_(4)间结合的氢键数目有助于提高5-HTP产量;酶和底物色氨酸结合情况不变,辅酶BH_(4)与酶间氢键数目越多,5-HTP产量越低。5-HTP产量最高的细胞工厂是由突变酶V195A/V197I构建的,5-HTP产量较野生酶构建的细胞工厂产量提高54%,1 L补料摇床发酵48 h,5-HTP产量达16.17 g/L。理性设计是提高TPH2酶活,突破5-HTP合成限速步骤的有效途径,TPH2和底物色氨酸、辅酶BH_(4)间氢键连接太多或太少都不利于其催化活性的发挥。

陶瓷超滤膜在5-羟基-L-色氨酸发酵产物提取中的应用

为提高5-羟基-L-色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan,5-HTP)提取分离效率,降低能耗和污染排放,选择陶瓷超滤膜应用于从发酵液中提取5-HTP的工艺,对陶瓷超滤膜的过滤条件进行优化.首先优选出适合的膜孔径为10 nm,进一步优化得到陶瓷超滤膜分离提取5-HTP的3个最优工艺参数:发酵液pH值3.5,跨膜压差0.75 MPa,料液过膜温度35℃.在此工艺条件下,5-HTP的透过率在92%以上,对游离蛋白质截留率达90%以上,满足进一步浓缩、结晶制备5-HTP的要求,达到了优化预期效果,为陶瓷超滤膜应用于从发酵液中工业化提取5-HTP提供了可靠依据.

基于表面增强拉曼光谱法的5-羟基色氨酸快速检测方法的研究

建立了一种基于表面增强拉曼光谱法快速测定食品中5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)的方法。本方法采用6次平行实验,样品使用乙腈提取,1 M硝酸反萃后与增强试剂混合上机检测,可以观测到良好的增强拉曼信号,线性范围在0~20 mg/kg,检出限为1 mg/kg。使用该方法检测市售的样品,并结合平行实验验证,检测结果和HPLC方法有较高的一致性。该方法具有操作简单、快速、高效的特点。

微生物合成5-羟基色氨酸的研究进展

5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)是血清素和褪黑素生物合成的中间代谢物,可有效治疗多种疾病,如抑郁症、头痛、肥胖和失眠等。传统生产5-HTP的方法是植物提取或化学合成,然而,这些方法效率低,难以大规模生产,无法满足不断增长的市场需求。随着代谢工程和合成生物学的发展,利用微生物合成目标产物成为必然趋势。笔者综述了微生物合成5-HTP的研究进展,通过定向进化羟化酶以及引入辅酶因子合成与再生途径,实现了微生物合成5-HTP,再经代谢工程调控,通过平衡宿主细胞内代谢流提高5-HTP生产效率,为工业微生物有效合成5-HTP提供了理论基础和技术支持。

磷酸盐和pH值协同调控大肠杆菌发酵合成5-羟基色氨酸

为了提高大肠杆菌合成5-羟基色氨酸能力,该研究设计构建了pSTV28-TPH150过表达质粒,增强了羟化酶基因TPH150的表达,以HTP10为出发菌株(代谢工程实验室保藏,专利号:CN202110714155.1),电转化pSTV28-TPH150质粒得到菌株HTP10-1,发酵结果显示,存在副产物L-色氨酸积累过多,质粒不稳定等问题,因此在初始发酵工艺的基础上,通过设计4个pH梯度进行发酵对比试验和4种不同磷酸二氢钾流加策略来探究最适发酵工艺。实验结果表明,在菌株HTP10-1发酵pH值为6.7,并于发酵培养基中添加1 g/L磷酸二氢钾,葡萄糖补料瓶中添加3 g/L磷酸二氢钾时,菌体比生长速率达到最优,发酵结束后5-羟基色氨酸积累量最高达到5.46 g/L,副产物L-色氨酸积累量减少到1.37 g/L,质粒丢失率较对照组减少32%,极大地提高了菌株HTP10-1的质粒稳定性,验证了磷酸盐与发酵pH调控菌体生长的可行性,对质粒工程菌的发酵控制具有重要参考意义。

L-5-羟基色氨酸衍生物的合成

目的:拓宽色氨酸衍生物的类别,以便合成单萜吲哚生物碱。方法:以商业易得的L-5-羟基色氨酸为原料,经羧基酯化、氨基Boc保护、酯的氨解、羟基的乙酰化或甲基化反应以及脱Boc保护等反应步骤合成L-5-羟基色氨酸衍生物。结果:高效合成了7个L-5-羟基色氨酸衍生物,分别为L-5-羟基色氨酸甲酰胺(1)、L-5-羟基色氨酸乙酰胺(2)、L-5-羟基色氨酸丙酰胺(3)、L-5-乙酰氧基色氨酸甲酯(4)、L-5-乙酰氧基色氨酸甲酰胺(5)、L-5-甲氧基色氨酸甲酯(6)和L-5-甲氧基色氨酸甲酰胺(7)。化合物4、5和7为新衍生物,所有衍生物的结构经波谱学方法确证。结论:该合成方法具有操作简单、反应条件温和、总收率高的特点,适用于工业化生产。

瘤胃保护性5-羟基色氨酸对绵羊肠道内容物褪黑素含量及菌群结构的影响

本试验旨在研究不同水平瘤胃保护性5-羟基色氨酸对绵羊胃肠道内容物中褪黑素含量及细菌多样性的影响,探究通过5-羟基色氨酸调节绵羊胃肠道细菌多样性的可能性。试验选取3岁、平均体重为(47.79±3.70)kg的健康哈萨克母羊15只,按体重相近原则随机分为3组,每组5只,分别为对照组和Ⅰ、Ⅱ组,每天每只羊的粉状精料饲喂量为1.2%(以体重计),玉米青贮为1.8 kg,混合干草自由采食,在此基础上,Ⅰ、Ⅱ组试验羊分别饲喂111、222 mg/(kg·BW)瘤胃保护性5-羟色氨酸,进行25 d的饲养试验。试验结束当天晨饲后6 h后立即宰杀全部绵羊,取其空肠、回肠、结肠、盲肠内容物测定褪黑素含量及菌群结构。结果表明,Ⅰ组结肠内容物,Ⅱ空肠、结肠内容物中褪黑素含量均极显著高于对照组(P<0.01),Ⅰ、Ⅱ组回肠、盲肠内容物中褪黑素含量均低于对照组,但差异不显著(P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ组空肠和盲肠内容物细菌菌群ACE、Chaol指数均低于对照组(P>0.05)。3组盲肠、结肠内容物中细菌多样性在门、属水平上均无显著差异(P>0.05)。而与对照组相比,Ⅰ组空肠内容物细菌中厚壁菌门相对丰度显著增加(P<0.05),无壁菌门相对丰度显著降低(P<0.05);在属水平上,Ⅱ组空肠内容物中Aeriscardovia属相对丰度显著增加(P<0.05)。在回肠内容物中,Ⅰ、Ⅱ组疣微菌属Ruminococcaceae-NK4A214相对丰度显著高于对照组(P<0.05),而梭状芽胞杆菌属、Romboutsia的相对丰度均显著低于对照组(P<0.05)。综上所述,瘤胃保护性5-羟基色氨酸使成年绵羊结肠内容物中褪黑素含量增加,但对肠道菌群多样性无显著影响。

重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。

瘤胃保护性5-羟基色氨酸对绵羊胃肠道内容物和血浆中5-羟基色氨酸、褪黑素含量的影响

本试验旨在研究绵羊胃肠道内容物中褪黑素的分布特点,探究瘤胃保护性5-羟基色氨酸对绵羊胃肠道内容物和血浆中5-羟基色氨酸、褪黑素含量的影响,探讨通过5-羟基色氨酸调节绵羊肠道中褪黑素合成的可能性。试验选取健康、平均体重为(47.79±3.70) kg的3岁哈萨克母羊15只,按体重分为3组,每组5只,分别为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ组。每天每只羊的粉状精料饲喂量为体重的1.2%,玉米青贮饲喂量为0.9 kg,混合干草自由采食,在此基础上,试验Ⅰ、Ⅱ组羊只分别饲喂111、222 mg/kg BW瘤胃保护性5-羟基色氨酸,进行15 d的饲养试验。结果表明:绵羊胃肠道内容物中5-羟基色氨酸含量的分布特点是盲肠>空肠、结肠>瘤胃液、十二指肠、回肠;褪黑素含量分布特点是十二指肠>瘤胃液、空肠>回肠、盲肠>结肠。除盲肠和结肠外,试验Ⅰ、Ⅱ组绵羊胃肠道内容物中5-羟基色氨酸含量极显著高于对照组(P<0.01)。试验Ⅱ组十二指肠内容物中5-羟色胺、N-乙酰-5-羟色胺含量极显著高于对照组(P<0.01),结肠内容物中5-羟色胺、N-乙酰-5-羟色胺含量显著高于对照组(P<0.05);试验Ⅰ组空肠、回肠内容物中5-羟色胺、N-乙酰-5-羟色胺含量极显著低于对照组、试验Ⅱ组(P <0.01)。试验Ⅰ、Ⅱ组结肠内容物中褪黑素含量极显著高于对照组(P<0.01)。试验Ⅰ、Ⅱ组十二指肠、空肠内容物中5-羟基吲哚乙酸含量极显著低于对照组(P<0.01),但试验Ⅱ组盲肠、结肠内容物中5-羟基吲哚乙酸含量极显著高于对照组(P<0.01)。试验Ⅱ组血浆中5-羟基色氨酸、5-羟色胺、褪黑素含量均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。由此可见,绵羊胃肠道内容物中5-羟基色氨酸含量的分布特点是:盲肠>空肠、结肠>瘤胃液、十二指肠、回肠;褪黑素含量分布特点是:十二指肠>瘤胃液、空肠>回肠、盲肠>结肠。瘤胃保护性5-羟基色氨酸补喂量为222 mg/kg BW时能提高胃肠道内容物中5-羟基色氨酸含量,但对5-羟色胺、褪黑素含量的影响在各胃肠段表现不同。瘤胃保护性5-羟基色氨酸补喂量为111、222 mg/kg BW时均能提高绵羊血浆中5-羟基色氨酸、5-羟色胺、褪黑素含量。

近红外光谱法测定5-羟基色氨酸的含量

本文利用近红外光谱法建立了5-羟基色氨酸的偏最小二乘(PLS)定量模型。采用相关数法选择波段以及二阶导数、Norris derivative平滑滤波进行数据预处理,所建校正模型的R为0.99907,RMSEC为0.0638,RMSEP为0.0675。经验证模型的预测性能良好,为5-HTP的快速测定提供了一种方法。

5-羟基色氨酸的光度分析

在 K2 HPO4 - Na2 HPO4 (p H=8.0 4 )缓冲液中 ,5-羟基色氨酸与苯并戊三酮生成灰紫色络合物。最大吸收波长在 570 nm处 ,表观摩尔吸光系数为 4 .73× 10 4 L· mol-1· cm-1。符合比耳定律的范围为 1—2 5.0 μg/ 10 m L,本法准确、快速 ,可用于产品测定 ,结果令人满意。

比值导数荧光光谱法同时测定色氨酸和5-羟基色氨酸

建立了比值导数荧光光谱法同时测定色氨酸和5-羟基色氨酸的方法。在比值导数荧光光谱法中，色氨酸浓度在4．0×10^-6～2．0×10^-5mol／L范围内比值导数荧光光谱峰高与其浓度成正比，线性相关系数为0．9901，检出限为1．3×10^-7mol／L。5一羟基色氨酸浓度在4．0×10^-8～2．0×10^-5mol／L范围内比值导数光谱峰高与其浓度成正比．线性相关系数为0．9996．检出限为1．3×10^-8mol／L。同时测定了实际样品中的色氨酸和5-羟基色氨酸，测定结果与高效液相色谱法有良好的一致性．

RP-HPLC法测定5-羟基色氨酸

建立了高效液相色谱法测定5-羟基色氨酸. 在优化条件下, 色谱柱： Symmetry C18柱;流动相： V（甲醇）：V（水）＝5：95;检测波长： 276 nm. 5-羟基色氨酸对照品溶液在0.8～4.0 μg的范围内与峰面积呈良好线性关系, r=0.9992;回收率为99.94%, RSD=1.35%.

正交试验法优选5-羟基色氨酸的提取工艺

目的研究5-羟基色氨酸的最佳生产工艺。方法以5-羟基色氨酸含量为指标,采用正交试验方法考察提取时间,提取次数,料液比,提取温度诸因素对5-羟基色氨酸提取量的影响。结果5-羟基色氨酸的最佳提取工艺为A2B3C2D2。结论在80℃下,恒温提取2次,每次3h,按1?15的料液比,确定为5-羟基色氨酸的最佳生产工艺条件。

加纳籽中5-羟基色氨酸的研究进展

5-羟基色氨酸主要存在于豆科植物中,尤其在加纳籽中含量居多。在体内,5-羟基色氨酸是5-羟色胺的前体,是一类重要的神经类药物。对5-羟基色氨酸的生物学作用、检测、生产方面的最新研究进行了概述,并对5-羟基色氨酸资源匮乏的问题提出了建议。

5-羟基色氨酸的提取和测定方法研究

目的:建立5-羟基色氨酸的提取和含量测定方法,进行不同提取条件时,药物中5-羟基色氨酸的含量比较。方法:高效液相色谱法,C18柱,流动相:甲醇∶水(5∶95),检测波长:276nm。结果:平均加样回收率为100.5%,RSD=1.23%。结论:本法准确,可作为5-HTP的质量控制。

5-羟基色氨酸专利检索与分析

目的]利用PatSnap智慧芽专利系统采用关键词的检索方式对5-羟基色氨酸进行检索,对检索获取的数据从专利的视角分析5-羟基色氨酸的研究现状,以期为中国企业今后的研究开发提供参考。[方法]以PatSnap智慧芽专利系统收录的专利为数据来源,通过关键词检索并对获取的数据对比分析专利申请及授权、技术来源国、目标市场国等情况。[结果]国外申请5-羟基色氨酸领域的专利已有60多年的历史,美国是最大的技术来源国和最大的目标市场国。普渡制药公司申请的专利最多,专利申请量排名前十的申请人都来自国外。中国是最近20年才开始申请这个领域的专利,申请的专利很大一部分是5-羟基色氨酸的分离制备工艺。[结论]对5-羟基色氨酸的深度开发和药物应用以及制备工艺中如何进一步提高5-羟基色氨酸产品质量、提高产品的得率、降低成本是中国企业今后研究开发的方向。

添喂5-羟基色氨酸、过瘤胃5-羟基色氨酸 对奶牛产奶量及血浆激素水平的影响

本试验以泌乳期奶牛为试验对象,研究添喂5-羟基色氨酸、过瘤胃5-羟基色氨酸对奶牛产奶量及血浆激素的影响。根据年龄、胎次、泌乳日龄相近的原则选取30头健康的荷斯坦牛,随机分成3组,每组10头牛,分别为对照组、试验Ⅰ组、Ⅱ组。对照组饲喂基础日粮(TMR),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别在基础日粮的基础上添喂20g 5-HTP和48g RP 5-HTP;试验期45d,其中预试期15d,正试期30d;分别于正试期第0、10、20、30天的05:00、11:00和17:00时采集血样,测定产奶量。结果表明:与对照组相比,试验Ⅱ组在第20天产奶量提高20.8%,差异显著(P<0.05)。在05:00时,试验Ⅰ组血浆INS含量显著降低(P<0.05);试验Ⅱ组血浆INS含量极显著降低(P<0.01)。在11:00时,试验Ⅰ组血浆GH含量极显著提高(P<0.01),PRL含量极显著降低(P<0.01);试验Ⅱ组血浆GH含量显著提高(P<0.05),PRL含量极显著降低(P<0.01),INS含量显著降低(P<0.05)。在17:00时,试验Ⅱ组血浆PRL、GH含量极显著提高(P<0.01),INS含量极显著降低(P<0.01)。因此,添喂5-羟基色氨酸、过瘤胃5-羟基色氨酸能够提高奶牛产奶量,提高血浆中PRL、GH含量,并以过瘤胃5-HTP效果更好。

O-(2-[^(18)F]氟代乙基)-5-羟基-L-色氨酸的合成、生物分布及MicroPET显像

通过对现有CTI公司计算机控制的化学合成模块(CPCU)进行改造,合成了L-5-羟基色氨酸类似物(5-18FEHTP),并用高效液相(HPLC)检测其放化纯度,所得产品用于昆明小鼠的S180肉瘤模型显像。结果显示,采用改进方法合成5-18FEHTP的总时间是45 min,放化收率为12%～16%(n=15),产品的放化纯度>98%。正常昆明小鼠体内生物分布显示,其脑组织摄取较低,最大摄取率为(2.354±0.405)%ID/g。血液清除较快,30 min时摄取率已降为(2.974±0.278)%ID/g。肾脏给药60 min摄取率值最大为(11.706±0.374)%ID/g,5-18FEHTP经过肾脏排出体外。MicroPET小鼠显像结果表明,5-18FEHTP在S180肉瘤中浓集程度明显高于周围其它组织。以上结果提示,利用CPCU半自动合成5-18FEHTP,方法简便、稳定,产品纯度较高。小鼠生物分布和显像结果表明,5-18FEHTP可能成为一种新的PET显像剂。

钯掺杂聚精氨酸修饰电极同时测定5-羟基色氨酸和多巴胺

制备了钯掺杂聚L-精氨酸修饰玻碳电极（Pd-PA/GCE）,研究了5-羟基色氨酸（5-HTP）和多巴胺（DA）在该修饰电极上的电化学行为,建立了同时测定5-HTP和DA的电化学新方法。在pH=2.0的磷酸缓冲溶液中,扫描速率为160mV/s时,DA在该电极上产生一对氧化还原峰,峰电位分别为0.515V和0.464V;5-HTP在该电极上产生一个氧化峰,峰电位为0.643V,两者的氧化峰电位差达128mV。在最优条件下,同时测定5-HTP和DA的线性范围分别为：9.00×10-7~1.00×10-5 mol/L、1.00×10-5~4.00×10-5 mol/L（5-HTP）;7.00×10-7~1.00×10-5 mol/L、1.00×10-5~4.00×10-5 mol/L（DA）。检出限分别为7.0×10-7 mol/L和5.0×10-7 mol/L。方法可用于药剂中5-HTP和DA的测定。