色氨酸羟化酶2理性设计提高大肠埃希菌5-羟基色氨酸产量

色氨酸羟化酶(TPH)可催化色氨酸羟化为5-羟基色氨酸(5-HTP),是5-HTP生物合成过程中的关键酶。为了提高大肠埃希菌细胞工厂合成5-HTP的效率,通过酶的理性设计和定点突变技术构建了人色氨酸羟化酶2(TPH2)的系列突变体,并在高产L-色氨酸且含有TPH辅酶四氢生物蝶呤(BH_(4))合成与再生模块的大肠埃希菌中表达。发现适当降低酶和色氨酸、酶和BH_(4)间结合的氢键数目有助于提高5-HTP产量;酶和底物色氨酸结合情况不变,辅酶BH_(4)与酶间氢键数目越多,5-HTP产量越低。5-HTP产量最高的细胞工厂是由突变酶V195A/V197I构建的,5-HTP产量较野生酶构建的细胞工厂产量提高54%,1 L补料摇床发酵48 h,5-HTP产量达16.17 g/L。理性设计是提高TPH2酶活,突破5-HTP合成限速步骤的有效途径,TPH2和底物色氨酸、辅酶BH_(4)间氢键连接太多或太少都不利于其催化活性的发挥。

植物阿魏酸-5-羟化酶生物信息学分析

阿魏酸-5-羟化酶(F5H)是木质素生物合成的关键酶之一,它依赖于细胞色素P450催化阿魏酸在5位上发生羟基化反应。采用生物信息学的方法和工具对在GenBank上注册的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)、杨树(Populus trichocarpa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、紫苜蓿(Medicago sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)等植物的阿魏酸-5-羟化酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括组成成分、氨基酸翻译后修饰、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级功能结构域等进行分析预测和推断。结果表明,植物F5H是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,存在于内质网等分泌途径中,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要结构元件,具有细胞色素P450家族特征性结构域及保守功能域。

柴胡疏肝散精简方对抑郁大鼠中缝核内5-羟色胺及色氨酸羟化酶2的影响

目的观察柴胡疏肝散精简方对抑郁大鼠中缝核内5-羟色胺及色氨酸羟化酶2的影响,探讨柴胡疏肝散精简方可能的抗抑郁机制。方法将40只SD雄性大鼠采用随机区组法分为空白组(control)、模型组(model)、氟西汀组(fluoxetine)、柴胡疏肝散精简方(Simplified Chaihu Shugan Powder,SCSP)组,每组10只,腹腔注射利血平建立大鼠抑郁模型,同时各药物组灌胃相应药物,连续14 d。通过行为学实验(糖水偏好实验、强迫游泳实验)评价大鼠抑郁状态,以高效液相色谱-电化学法(high performance liquid chromatography-electrochemical detector,HPLC-ECD)测定中缝核内5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的含量,以反转录聚合酶链式反应法(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)测定中缝核内色氨酸羟化酶2(tryptophan hydroxylase 2,TPH2)的含量。结果与空白组比较,模型组体质量、体质量增量、糖水偏好指数明显降低(P <0. 01),游泳不动时间明显增加(P <0. 01),中缝核内TPH2、5-HT含量明显减少(P <0. 01)。与模型组比较,氟西汀组及SCSP组体质量、体质量增量明显增加(P <0. 01),糖水偏好指数增加(P <0. 05),游泳不动时间明显减少(P <0. 01),中缝核内TPH2、5-HT含量明显增加(P <0. 01)。结论柴胡疏肝散精简方对利血平致抑郁模型大鼠具有一定的抗抑郁作用,与氟西汀效果相当其作用机制可能与增加中缝核内TPH2的含量,促进5-HT的生成有关。

毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶对烟草木质素的影响

为了研究阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)在木质素合成途径中的调控作用,采用CTAB法提取毛白杨RNA,反转录得到c DNA并克隆出毛白杨F5H基因,将其以正义、反义、干涉的基因形式,使用农杆菌侵染法导入烟草基因组中。将得到的转基因植株茎段进行解剖分析,并测定其木质素细胞壁化学组成。转基因植株的木质素、纤维素总量和木质部解剖分析结果与野生型相比均为未表现出明显差异,植株正常生长。F5H的过量表达和基因沉默均不影响植株木质化和生长,可以说明它是木质素合成途径可供选择的一个很好的调控点。

脑出血后抑郁模型大鼠脑内5-羟色胺、去甲肾上腺素和酪氨酸羟化酶的表达

目的:观察脑出血后抑郁动物模型脑内单胺神经递质5-羟色胺、去甲肾上腺素和酪氨酸羟化酶的表达变化,分析脑出血后抑郁症的发生机制。方法:实验于2004-02/2005-01在北京中医药大学科研中心进行,健康Wistar雄性大鼠32只,随机分为正常组,脑出血组、抑郁组、模型组,每组8只,正常组常规喂养;脑出血组仅进行脑出血手术,术后常规喂养;抑郁组正常饲养7d后,予21d的慢性应激;模型组先进行脑出血手术,术后常规喂养7d后,予21d的慢性应激。应激结束后,采用免疫组织化学方法观察脑出血后抑郁模型大鼠脑内5-羟色胺、去甲肾上腺素、酪氨酸羟化酶的表达改变。结果:各组大鼠全部进入结果分析。①脑内5-羟色胺阳性细胞的表达:模型组大鼠脑海马CA1、CA3、CA4、梨状皮质、扣带皮质、下丘脑内5-羟色胺阳性细胞表达减少,颜色浅淡,与正常组比较有统计学显著性意义。脑出血组5-羟色胺阳性细胞在海马CA3、CA4、梨状皮质、扣带皮质、下丘脑数量表达减少,与正常组比较有统计学显著性差异。慢性应激抑郁组在海马CA1、CA3、梨状皮质、扣带皮质、下丘脑5-羟色胺阳性细胞表达减少,与正常组比较有统计学显著性差异。②酪氨酸羟化酶和去甲肾上腺素的表达:模型组、出血组、抑郁组下丘脑内酪氨酸羟化酶阳性细胞表达减少,颜色变浅,与正常组比较有统计学差异。脑出血组、抑郁组、模型组去甲肾上腺素阳性细胞在扣带皮质和下丘脑内颜色变浅,呈空泡样,较正常组明显减弱(P<0.05)。结论:脑出血后抑郁症模型大鼠脑内5-羟色胺和去甲肾上腺素和酪氨酸羟化酶表达下降。

桑树阿槐酸5-羟化酶基因的克隆及遗传转化

阿槐酸5-羟化酶(ferulic acid 5-hydroxylase,F5H)是催化S木质素合成的关键酶。为研究桑树F5H对S木质素合成的影响,从野生川桑中克隆得到一个阿槐酸5-羟化酶基因,命名为MnF5H(GenBank登录号:KC152637)。该基因ORF为1 515 bp,编码504个氨基酸,预测蛋白质分子质量56.77 kD,等电点6.45,具有细胞色素P450单加氧酶保守结构域。系统进化树中,MnF5H蛋白与来源于桑科构属的光叶楮的同源蛋白聚在一起,表明阿槐酸5-羟化酶在进化上具有保守性。通过荧光定量PCR检测到MnF5H基因在木质化的桑树根部高量表达,暗示该基因与木质素的形成密切相关。在烟草中超量表达MnF5H基因,经组织化学染色发现S木质素合成增加,G木质素合成减少,但木质素总含量基本不变。研究结果表明该基因在控制S木质素的合成中起关键作用。

色氨酸羟化酶1与5-羟色胺2A受体基因对抑郁症患者额叶情绪加工的影响

目的:分析色氨酸羟化酶1(TPH1)基因A218C多态性、5-羟色胺(5-HT)2A受体基因(HTR2A)T102C多态性对抑郁症患者额叶情绪识别功能异常的影响。方法:28例抑郁症患者(患者组)及34名性别、年龄、受教育年限相匹配的健康对照(对照组)均进行情绪识别任务态下功能磁共振扫描,并以聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法确定所有被试基因型,提取双侧额叶上、中、下回为感兴趣脑区,比较不同基因型两组额叶亚区激活强度的差异。结果:①喜悦面部表情识别时,TPH1AA基因型患者组右额中回激活强度较其他各组显著降低;HTR2ACC基因型患者组右额中回激活较AA、AC基因型患者组及AA、AC基因型对照组显著降低(P<0.05)。②悲伤面部表情识别时,TPH1AA基因型患者组、对照组左额下回激活较AC、CC基因型患者组、对照组显著增强,同时AA基因型患者组右额下回激活强度较其他各组显著增强;HTR2ACC基因型患者组右额中回激活强度较TT、TC基因型患者组、TT基因型对照组显著增强,右额下回激活强度较TT、TC基因型患者组、TT、TC基因型对照组显著增强(P<0.05)。③TPH1A218C与HTR2AT102C对右额中回正性情绪识别、右额下回负性情绪识别时激活异常存在叠加作用,同时携带TPH1AA基因型及HTR2ACC基因型患者表现出的正性激活减弱及负性激活增强最为显著(P<0.05)。结论:抑郁症患者额叶异常具有一定的5-HT遗传学基础,5-HT系统中的不同基因能够通过共同的5-HT能作用引起情绪识别功能异常。

双相障碍患者血清中色氨酸羟化酶、5-羟色胺水平与临床特征的关系

目的探讨双相障碍患者血清色氨酸羟化酶(TPH)、5-羟色胺(5-HT)水平与临床特征的关系。方法选取2017年6月至2019年2月在该院精神科首次诊断为双相障碍患者100例作为观察组,根据有无童年创伤分为无童年创伤组(39例)和有童年创伤组(61例);选取同期体检健康者100例作为对照组。采集清晨外周血提取血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清TPH、5-HT水平;对双相障碍患者进行汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、Young躁狂量表(YMRS)、大体功能评定量表(GAF)测评;记录入组12个月内的抑郁发作次数、躁狂发作次数、抑郁发作时间和躁狂发作时间;采用Pearson法分析双相障碍患者血清TPH、5-HT水平与HAMD、YMRS、GAF评分、抑郁发作次数、躁狂发作次数、抑郁发作时间和躁狂发作时间的相关性;采用多因素Logistic回归分析影响双相障碍发生的因素。结果与对照组相比,观察组双相障碍患者血清TPH、5-HT水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与无童年创伤组相比,有童年创伤组双相障碍患者血清TPH、5-HT水平、GAF评分均明显降低,HAMD、YMRS评分均明显升高,抑郁发作次数、躁狂发作次数、抑郁发作时间、躁狂发作时间均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。双相障碍患者血清TPH、5-HT水平与HAMD、YMRS评分、抑郁发作次数、躁狂发作次数,5-HT水平与躁狂发作时间均呈负相关(P<0.05)。血清TPH、5-HT水平与GAF评分均呈正相关(P<0.05);血清TPH、5-HT水平为影响双相障碍发生的保护因素(P<0.05),童年创伤是影响双相障碍发生的危险因素(P<0.05)。结论双相障碍患者血清TPH、5-HT水平明显降低,受童年创伤影响,与心理功能、社会功能及入组12个月内发病情况等临床特征关系紧密,是影响疾病发生的保护因素,可用来作为双相障碍患者病情的参考。

陶瓷超滤膜在5-羟基-L-色氨酸发酵产物提取中的应用

为提高5-羟基-L-色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan,5-HTP)提取分离效率,降低能耗和污染排放,选择陶瓷超滤膜应用于从发酵液中提取5-HTP的工艺,对陶瓷超滤膜的过滤条件进行优化.首先优选出适合的膜孔径为10 nm,进一步优化得到陶瓷超滤膜分离提取5-HTP的3个最优工艺参数:发酵液pH值3.5,跨膜压差0.75 MPa,料液过膜温度35℃.在此工艺条件下,5-HTP的透过率在92%以上,对游离蛋白质截留率达90%以上,满足进一步浓缩、结晶制备5-HTP的要求,达到了优化预期效果,为陶瓷超滤膜应用于从发酵液中工业化提取5-HTP提供了可靠依据.

饮食限制对运动训练大鼠脑干5-HT、5-HIAA及色氨酸羟化酶的影响

目的:通过检测不同比例饮食限制对运动大鼠脑组织5-HT含量及其关键酶色氨酸羟化酶的影响,探讨饮食限制与运动性中枢疲劳的关系;方法:以40只成年雄性SD大鼠为实验对象,建立不同限制饮食动物模型。实验分组为安静对照组(NC)、100%饮食运动组(100%DR)、70%饮食运动组(70%DR)、50%饮食运动组(50%DR)、30%饮食运动组(30%DR),每组8只,饮食限制时间为10天,运动方案为每天进行游泳训练30min。采用高效液相色谱法测定脑干区5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量;采用RT-PCR分析脑干色氨酸羟化酶TPHmRNA表达量的变化;结果:1)各运动组大鼠脑干5-HT含量均高于安静对照组,但仅有30%饮食运动组有显著性增加(P<0.05);2)5-羟吲哚乙酸含量表现为30%DR组显著高于对照组和100%DR组(P<0.05);3)大鼠脑干区TPHmRNA的表达水平显示,30%DR组显著高于NC组和100%DR运动组(P<0.05),与100%DR组相比,各限食组均有显著性差异(P<0.05);结论:不同比例的饮食限制导致大鼠脑干5-HT和5-HIAA的生成增加,且增加量与饮食限制程度有关,其原因可能与饮食限制促进脑干TPH-mRNA的表达有关。

大鼠脑斜角带中5-羟色胺、酪氨酸羟化酶、催产素载体蛋白、内啡肽与促性腺激素释放激素系统的分布关系

本文用免疫组织化学方法对大鼠脑Broca斜角带中促性腺激素释放激素(GnRH),5-羟色胺(5-HT),酪氨酸羟化酶(TH),催产素载体蛋白(NP)和内啡肽(β-END)之间的分布关系进行了观察.结果表明,在垂直带的腹内侧区和水平带的背内侧区,5-HT,TH,NP,β-END纤维与GnRH胞体和纤维有密切的重叠分布,在垂直带的背内侧区有5-HT纤维与GnRH神经元重叠分布.此外还在垂直带和水平带内侧区发现有TH和NP阳性神经元。对GnRH与5-HT,TH,NP和β-END的重叠分布关系和功能意义进行了讨论。

慢性低强度应激抑郁症模型大鼠组织中5-羟色胺和色氨酸羟化酶的表达变化

目的:为抑郁症治疗药物的开发提供依据和思路。方法:将适应性喂养7d的大鼠随机分为正常组、抑郁组和治疗组(氢溴酸西酞普兰1 mg/kg),每组8只,抑郁组和治疗组大鼠每天随机给予1次低强度刺激[夹尾刺激(1min)、频闪照明刺激(120次/min,12h)、噪声刺激(4h)、冰水游泳刺激(1h)、热水刺激(45℃,1h)、电击足底(10 Hz,1mA,每次间隔100 ms,100次)、禁食禁水(24h)],连续21 d建立应激抑郁症模型。分别于适应性喂养第0、7天和应激第7、14、21天称量各组大鼠体质量,检测旷场实验中大鼠的水平移动频率和垂直活动频率。应激结束后,各组大鼠ig相应药物,连续30d后检测脑、肝、肾组织中5-羟色胺(5-HT)和色氨酸羟化酶(TPH)的表达。结果:与正常组比较,抑郁组和治疗组大鼠从应激第14天起体质量增加趋势减慢(P<0.05)。抑郁组和治疗组大鼠应激第14、21天的水平移动频率较前一时间点明显降低(P<0.05或P<0.01),应激第21天的垂直活动频率较前一时间点明显降低(P<0.05或P<0.01);给药30 d后,治疗组大鼠水平移动频率和垂直活动频率较前一时间点明显升高(P<0.01)。与抑郁组比较,治疗组大鼠脑、肾组织中的5-HT水平明显增加(P<0.05),脑组织中TPH水平明显增加(P<0.05)。结论:应激大鼠模型抑郁症的发生与大鼠脑组织中TPH表达的降低从而导致5-HT水平降低有关,提示TPH可作为抑郁症治疗的靶点。

基于表面增强拉曼光谱法的5-羟基色氨酸快速检测方法的研究

建立了一种基于表面增强拉曼光谱法快速测定食品中5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)的方法。本方法采用6次平行实验,样品使用乙腈提取,1 M硝酸反萃后与增强试剂混合上机检测,可以观测到良好的增强拉曼信号,线性范围在0~20 mg/kg,检出限为1 mg/kg。使用该方法检测市售的样品,并结合平行实验验证,检测结果和HPLC方法有较高的一致性。该方法具有操作简单、快速、高效的特点。

哺乳期使用氟西汀对子代大鼠行为学及5-羟色胺转运体和色氨酸羟化酶影响研究

目的观察哺乳期使用氟西汀对子代大鼠行为学及5一羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）和色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）蛋白的影响。方法妊娠SD大鼠随机分为2组，每组各3只。待分娩后5—21d予以实验组母鼠腹腔注射氟西汀（12mg/kg），对照组母鼠腹腔注射等量生理盐水，期间正常哺乳，第21d断奶。每只母鼠的子代中各挑选8只，婴儿期不同时间点分别测量体重、毛发、睁眼以评价生长发育，听觉、埋藏食物小球和自由悬挂实验评价其神经反射和运动行为；儿童期和青年期（出生后35d和75d）分别取实验组和对照组子代大鼠各6只，取脑组织行免疫组织化学染色检测前额皮质SERT及TPH水平。结果婴儿期氟西汀组子代大鼠体重较对照组低（P〈0．05），听觉敏感性得分较对照组高（P〈0．01），自由悬挂实验时间较对照组短（P〈0．01）。儿童期和青年期时氟西汀组子代前额皮质SERT及TPH均较对照组降低（P〈0．05）。结论哺乳期母鼠暴露于氟西汀可能通过下调子代大鼠前额皮质SERT和TPH导致其发育和行为异常。

滋肾疏肝中药治疗更年期抑郁症疗效及对5-羟色胺、色氨酸羟化酶2的影响

目的探讨滋肾疏肝中药治疗更年期抑郁症疗效及对5-羟色胺(5-HT)、色氨酸羟化酶2(TPH2)的影响。方法将120例更年期抑郁症患者随机分为2组,对照组60例给予氟哌噻吨美利曲辛治疗,观察组60例在此基础上加用滋肾疏肝中药治疗,观察2组治疗前后中医证候积分、HAMD量表评分、SDS量表评分、5-HT及TPH2水平,统计2组近期疗效和不良反应发生情况。结果 2组治疗后情绪低落、郁闷烦躁、行为迟滞、胸胁胀痛、腰膝酸软积分,焦虑、认知障碍、阻滞、体质量、昼夜、睡眠障碍、绝望感评分及SDS评分均显著低于治疗前(P均<0.05),且观察组治疗后各项评分均显著低于对照组(P均<0.05);2组治疗后5-HT和THP2水平均显著高于治疗前(P均<0.05),且观察组治疗后各项指标水平均显著高于对照组(P均<0.05);观察组近期总有有效率显著高于对照组(P<0.05);2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论滋肾疏肝中药治疗更年期抑郁症可有效缓解临床症状体征,改善负面情绪状态,上调,5-HT和THP2水平,且未增加不良反应发生风险。

探讨肠易激综合征与色氨酸羟化酶和5-羟色胺转运体之间联系

肠易激综合征(IBS)是一种慢性胃肠功能紊乱性疾病,其临床表现主要以抑郁或焦虑症状和肠道症状为主,虽有明确的诊断标准,但发病机制目前尚无定论。现代研究发现IBS的发病与5-羟色胺(5-HT)的分泌异常有关,5-HT是体内重要的神经递质,5-HT信号系统包括5-HT的合成、释放、与受体结合、重吸收等多个过程。文章就以5-HT信号系统为切入点,对5-HT的前体合成物质--色氨酸羟化酶(TPH)和重吸收物质--5-羟色胺转运体(SERT)与IBS的关系作一综述。

RP-HPLC双波长切换法同时测定天舒胶囊中天麻素、阿魏酸和6,7-二羟基藁本内酯的含量

目的建立反相高效液相色谱-双波长切换法同时测定天舒胶囊中天麻素、阿魏酸和6,7-二羟基藁本内酯的含量。方法采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-体积分数0.1%乙酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL.min-1,检测波长为270 nm(天麻素)、320 nm(阿魏酸和6,7-二羟基藁本内酯),柱温35℃。结果在15 min内天舒胶囊中天麻素、阿魏酸和6,7-二羟基藁本内酯质量浓度分别在30.50～305.0 mg.L-1(r=0.999 2)、34.96～349.6 mg.L-1(r=0.999 7)和46.54～465.4 mg.L-1(r=0.999 4)内与峰面积线性关系良好;平均加样回收率分别为98.8%、98.7%和98.2%,RSD分别为1.9%、1.2%和2.1%。结论本方法操作简便,结果准确,与《中华人民共和国药典》所述方法相比,增加了含量测定指标,提高了全面控制天舒胶囊质量的水平。

蛋氨酸合成酶催化反应研究Ⅴ:5-氨基-6-(3-羟基-4-溴丁基)尿嘧啶的合成研究

报导了 5 氨基 6 (3 丁烯基 )尿嘧啶、5 氨基 6 (3 羟基 4 溴丁基 )尿嘧啶的合成方法 .以γ 取代的β 酮酯和O 甲基异尿硫酸盐为起始物 ,经 6 取代尿嘧啶 (3)、6 取代 5 偶氮尿嘧啶 (4)和未见文献报道的中间体 6 ,首次合成了 5 氨基 6 (3 丁烯基 )尿嘧啶 (5 )及 5 氨基 6 (3 羟基 4 溴丁基 )尿嘧啶 (7)

重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。

蜂王浆在贮藏过程中5-羟甲基糠醛、10-羟基-2-癸烯酸及精氨酸双糖苷含量的变化

将10个蜂王浆样品贮藏在不同温度(室温、4、-20、-80℃)和时间(15、45、65、80 d)条件下,采用高效液相色谱法检测其5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)、10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decanoic acid,10-HDA)和精氨酸双糖苷(arginyl fructosyl glucose,AFG)含量的变化。结果表明,蜂王浆样品中10-HDA的含量稳定,不随贮藏温度和时间的变化而变化;5-HMF和AFG的含量随贮藏温度升高及时间的延长而增加。因此5-HMF和AFG可作为衡量蜂王浆新鲜程度的指标性成分,而10-HDA不可以作为此标准。但10-HDA是蜂王浆中特有成分,其含量高低会直接影响蜂王浆的功效,故5-HMF、AFG与10-HDA三者结合对蜂王浆的品质进行评价会更加准确。