鼻咽癌组织中Gli1的表达及其对5-8F细胞增殖和迁移的影响

目的:研究神经胶质瘤相关癌基因1(Gli1)在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞5-8F增殖和迁移的影响。方法:采用荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测40例鼻咽癌组织和12例正常鼻咽组织中Gli1的表达;设计并合成针对Gli1基因的RNAi片段,将其感染5-8F细胞,蛋白质印迹法检测Gli1蛋白表达;MTT实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验和Boyden实验分别研究Gli1基因沉默后对5-8F细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:Gli1在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常鼻咽组织,将siRNA-Gli1-01和siRNA-Gli1-02转染入5-8F细胞后,5-8F细胞中Gli1蛋白表达水平明显降低,细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱。结论:Gli1基因的表达异常与鼻咽癌的发生发展相关,有望成为鼻咽癌早期诊断和预测预后的生物分子标志物。

自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F存活、凋亡的影响及其机制

目的观察自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F存活、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将对数生长期5-8F细胞分为8组,5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清,20%空白血清组加入20%不含药血清,对照组细胞正常培养,培养24、48 h,CCK-8法检测各组细胞存活率。将对数生长期5-8F细胞分为4组,低剂量组加入5%鼻咽解毒胶囊含药血清,中剂量组加入20%鼻咽解毒胶囊含药血清,高剂量组加入30%鼻咽解毒胶囊含药血清,阴性组细胞正常培养,培养24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-qPCR法检测细胞中K-RAS、RAF mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞中K-RAS、RAF、p-ERK1/2蛋白相对表达量。结果与对照组比较,20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组培养24 h及48 h的细胞存活率降低(P均<0.05);与20%空白血清组比较,25%含药血清组培养48 h和30%含药血清组培养24、48 h的细胞存活率降低(P均<0.05);与同组24 h比较,30%含药血清组培养48 h的细胞存活率降低(P<0.05)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率升高(P均<0.05);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组细胞凋亡率升高(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组的K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05)。与阴性组比较,高剂量组K-RAS蛋白、RAF蛋白、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低,中剂量组的K-RAS、RAF蛋白相对表达量降低,低剂量组RAF蛋白相对表达量降低(P均<0.05);与低剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAF、p-ERK1/2蛋白相对表达量及中剂量组K-RAS、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论自制鼻咽解毒胶囊含药血清能抑制5-8F细胞存活,并促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性,尤以30%鼻咽解毒胶囊含药血清剂量为最佳,作用机制可能与其可抑制MAPK/ERK信号通路有关。

circHIPK3促进鼻咽癌细胞5-8F迁移和侵袭的机制

目的探讨环状RNA HIPK3(circHIPK3)在鼻咽癌(NPC)细胞迁移和侵袭中的作用及其分子机制。方法检索公共数据库,运用高通量基因表达数据库(GEO)分析NPC组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;合成circHIPK3-siRNA转染NPC 5-8F细胞;采用RT-qPCR、Western blot、细胞划痕、CCK-8和Transwell等实验方法,研究确定circHIPK3-siRNA干扰效果后,检测它对细胞增殖、迁移和侵袭及潜在下游基因CDH1、CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3表达的影响。运用转录组测序技术分析5-8F细胞circHIPK3-siRNA干扰后显著差异表达的基因,以期找到介导circHIPK3促癌作用的关键基因。结果与非癌组织相比,NPC组织中circHIPK3表达明显增加(P<0.05)。使用siRNA特异性敲低5-8F细胞中circHIPK3的表达后,与对照组相比,si-circHIPK3组细胞增殖速率降低(P<0.05),si-circHIPK3组细胞划痕闭合率降低(P<0.01),同时si-circHIPK3组细胞迁移和侵袭的细胞数目减少(P<0.05)。此外,与对照组相比,si-circHIPK3组下游基因CDH1 mRNA和蛋白的表达量升高(P<0.001),CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3 mRNA和蛋白的表达量减少(P<0.05)。进一步测序分析显示,circHIPK3-siRNA转染的5-8F细胞中AL645922.1、SCO_(2)、AL136295.1和ISY1-RAB43表达上调(P<0.05),BIVM-ERCC5、FAM47E-STBD1、INO80B-WBP1、NAIP、C15orf38-AP3S2、BCL2L2-PABPN1和SMIM11B表达下调(P<0.05)。结论NPC组织中circHIPK3表达显著升高。circHIPK3通过调节E-Cadherin、N-Cadherin、MMP2、MMP9和IL-6/STAT3的表达,促进NPC细胞5-8F的增殖、迁移和侵袭。AL645922.1和BIVM-ERCC5等基因可能在circHIPK3介导的促进NPC 5-8F细胞迁移和侵袭中发挥关键作用。

益气解毒方通过Wnt/β-catenin信号通路诱导鼻咽癌5-8F细胞凋亡

目的基于Wnt/β-catenin信号通路探讨益气解毒方(黄芪、黄连、白花蛇舌草等)对鼻咽癌5-8F细胞凋亡的作用机制。方法(1)将5-8F细胞分为空白对照组、益气解毒方不同浓度组(0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL^(-1))及顺铂组(4μg·mL^(-1)),采用实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)监测细胞的增殖情况。(2)将5-8F细胞分为5组:空白对照组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、HLY7810μmol·L^(-1)组、HLY7810μmol·L^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、IWR-18μmol·L^(-1)组,采用RTCA监测细胞的增殖;药物干预36 h后,采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡率;JC-1荧光探针法检测细胞线粒体膜电位;Western Blot法检测细胞β-catenin、Wnt5a/b、Bcl2及Bax蛋白的表达水平。结果与空白对照组比较,益气解毒方不同浓度组(0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL^(-1))的5-8F细胞增殖曲线均明显降低;益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、IWR-18μmol·mL^(-1)组的细胞凋亡率显著升高(P<0.01),线粒体膜电位明显降低,β-catenin、Wnt5a/b及Bcl2蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表达显著上调(P<0.01),Bax/Bcl2比值显著升高(P<0.01)。与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,HLY7810μmol·L^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的5-8F细胞增殖曲线明显升高,细胞凋亡率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位明显升高,β-catenin、Wnt5a/b及Bcl2蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表达显著下调(P<0.01),Bax/Bcl2比值显著降低(P<0.01)。结论益气解毒方能够抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,并诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。

小干扰RNA抑制内源性原癌基因c-myc表达对鼻咽癌细胞5-8F的影响

目的通过RNA干扰抑制鼻咽癌5-8F细胞内源性原癌基因c-myc的过表达,观察c-myc过表达受到抑制后对5-8F细胞生物学特性的影响。方法构建针对c-myc的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染5-8F细胞,建立稳定转染干扰组细胞5-8F/si-c-myc;同法建立阴性对照组细胞5-8F/si-control,并以5-8F为空白对照组细胞;通过半定量反转录聚合酶链反应和Western blot分别检测c-myc mRNA和蛋白水平表达,鉴别干扰效果;通过四甲基偶氮唑蓝比色法检测干扰前后对5-8F细胞生长的影响;通过流式细胞仪分析干扰前后对5-8F细胞周期的影响;通过透射电镜扫描观察干扰前后对5-8F细胞超微结构的影响。结果与空白对照组和阴性对照组细胞相比,干扰细胞组c-myc mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P<0.05),细胞生长活力显著降低(P<0.05),细胞周期G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例显著降低(P<0.05),细胞超微结构发生明显改变。结论干扰内源性c-myc的siRNA能显著抑制5-8F的细胞生长和细胞分裂增殖,c-myc基因有可能成为鼻咽癌基因治疗新靶点。

阿司匹林对鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞增殖、迁移与侵袭作用机制研究

目的 探讨阿司匹林对人鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞增殖、迁移与侵袭的影响和机制。方法 将人鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞株分为对照组和阿司匹林(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L)处理组。噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度阿司匹林作用24、48、72 h后对CNE-1、5-8F细胞的增殖能力,以半数抑制浓度(IC50)作为后续实验药物处理浓度。集落形成实验检测CNE-1和5-8F细胞增殖能力,Transwell实验检测CNE-1和5-8F细胞迁移及侵袭能力的变化,Western blotting法检测CNE-1和5-8F细胞中蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Snail蛋白相对表达水平。结果 人鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞分别经1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L阿司匹林处理后,细胞增殖均受到不同程度抑制,且呈时间及浓度相关性,IC50分别为3.3、2.7 mmol/L。与对照组相比,经阿司匹林处理后,鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞的细胞增殖和集落形成能力明显下降(P<0.01)。与对照组相比,经阿司匹林处理后,划痕愈合率显著降低(P<0.05)。Trasnwell迁移实验结果表明,与对照组相比,阿司匹林处理组鼻咽癌细胞CNE-1和5-8F 48 h穿过小室的数目显著减少(P<0.05、0.001)。与对照组相比,阿司匹林处理组CNE-1、5-8F细胞的E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05),PI3K、Akt、Vimentin、Snail蛋白表达显著下降(P<0.05、0.01)。结论 阿司匹林可通过上调E-cadherin蛋白的表达、抑制上皮间质转化进程从而抑制人鼻咽癌CNE-1、5-8F细胞迁移侵袭,同时下调PI3K、Akt、Vimentin、Snail蛋白的表达进而抑制CNE-1、5-8F细胞增殖、迁移和侵袭能力。

米碎花的酚苷类化合物及其鼻咽癌细胞毒活性

为了解米碎花(Eurya chinensis)的化学成分及其生物活性,运用多种色谱技术从其乙醇提取物分离得到11个化合物,并对化合物进行体外抗鼻咽癌细胞增殖活性评价。经波谱数据分析,分别为异落新妇苷(1)、3,5,7-三羟基色原酮-3-O-α-L-鼠李糖苷(2)、1-O-反式-桂皮酰基-β-D-葡萄糖(3)、1-O-(4-羟基苯乙基)-6-O-反式-桂皮酰基-β-D-葡萄糖(4)、eutigoside D(5)、1-O-(3,4-二羟基苯乙基)-6-O-反式-香豆酰基-β-D-葡萄糖(6)、eutigoside A(7)、1-O-(4-羟基苯乙基)-6-O-反式-咖啡酰基-β-D-葡萄糖(8)、grayanoside A(9)、1-O-(4-羟基苯乙基)-6-O-(4-羟基苯甲酰基)-β-D-葡萄糖(10)、3-O-β-D-葡萄糖基-4-羟基-苄基苯甲酸酯(11)。其中,化合物4为首次从天然来源获得,化合物2~4和8~11均为首次从该属植物中分离得到。MTT法表明,化合物10具有中等抑制5-8F细胞增殖活性。

慢病毒转染对鼻咽癌细胞5-8F增殖迁移的影响

目的:探讨慢病毒转染对鼻咽癌细胞株5-8F增殖、迁移的影响,以验证慢病毒转染是否能有效的应用于鼻咽癌细胞的增值及迁移相关研究。方法:以红色荧光标记的慢病毒为转染载体,选定不同的MOI值转染鼻咽癌5-8F细胞株,扩大培养后筛选纯化,流式细胞仪检测转染效率。以最佳MOI值转染后的5-8F(RFP-5-8F)细胞为实验组,未转染的亲代5-8F为空白对照组,取对数生长期未转染的亲代5-8F和红色荧光标记的慢病毒转染的5-8F(RFP-5-8F)细胞进行MTT、划痕实验,观察细胞镜下形态,了解细胞转染前后生长曲线,细胞迁移能力的变化。结果:流式细胞仪检测5-8F细胞慢病毒转染效率大于95%,转染最佳MOI值为30,镜下荧光强度适中。实验组与对照组比较,转染前后5-8F细胞光镜形态相似,生长曲线一致,差异无统计学意义(P=0.997),划痕实验显示5-8F与RFP-5-8F细胞迁移能力一致,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒转染后鼻咽癌细胞能真实有效的的反应原细胞的增值及迁移能力,可以很好的应用于鼻咽癌增殖及其转移机制的相关研究。

siRNA沉默LOX基因对鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力的影响

目的:探讨RNAi干扰赖氨酰氧化酶基因(LOX)后对鼻咽癌细胞5-8F侵袭及迁移能力的影响。方法:设计并构建针对LOX基因的RNAi片段,脂质体介导siRNA-LOX-01(siRNA-LOX-01组)和siRNALOX-02(siRNA-LOX-02组)转染5-8F细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测转染后各组LOX的mRNA和蛋白表达及上皮间质转化(EMT)相关指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、MMP9等的表达变化;细胞黏附实验、基底膜侵袭实验和细胞划痕实验分别研究LOX基因沉默后对5-8F细胞侵袭及迁移能力的影响。结果:与对照组相比,siRNA-LOX-01组和siRNA-LOX-02组LOX表达在mRNA及蛋白水平下降,细胞的迁移速率变慢,穿膜细胞数减少,细胞黏附率增加(均P<0.05),E-cadherin的表达增加,N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9的表达减少。结论:干扰LOX能明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭及迁移能力,作用机制可能与N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9蛋白表达下调有关,LOX有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

siRNA抑制LOX基因对鼻咽癌细胞增殖能力的影响

目的探讨si RNA扰赖氨酰氧化酶基因(LOX)后对鼻咽癌细胞5-8F的体外增殖的影响。方法设计并构建针对LOX基因的si RNA段,脂质体介导Si RNA-LOX-01(Si RNA-LOX-01组)和Si RNA-LOX-02(Si RNALOX-02组)转染5-8F细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测转染后各组LOX m RNA和蛋白表达及Ki-67、PCNA、CDK4、P21、CCND1表达变化;MTT实验、平板克隆形成实验及流式细胞周期实验分别研究LOX基因沉默后对5-8F细胞增殖能力的影响。结果与对照组比较,Si RNA-LOX-01组和Si RNA-LOX-02组LOX表达在m RNA及蛋白水平上均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,si RNA-LOX细胞的增殖速度变慢,单克隆形成数量减少,细胞周期中G0/G1期细胞的比例显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与对照组相比,Si RNA-LOX-01组和Si RNA-LOX-02组细胞中抗原Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白D1(CCND1)的表达均降低,P21表达量升高,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论干扰LOX能明显抑制鼻咽癌细胞的增殖能力,其作用机制可能与Ki-67、PCNA、CDK4及CCND1蛋白表达下调,P21蛋白表达上调有关,LOX有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

UBE2T基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的探讨泛素结合酶E2T(UBE2T)基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法选取鼻咽癌细胞系5-8F细胞,随机分为对照组、空白转染组和si-UBE2T组,其中空白转染组细胞转染空白载体,si-UBE2T组细胞转染UBE2T特异性siRNA载体,采用MTT法检测各组细胞增殖情况,采用Transwell迁移侵袭试验检测各组细胞迁移和侵袭,Western blotting法检测各组细胞UBE2T蛋白表达。结果 si-UBE2T组UBE2T蛋白相对表达量为(0. 354±0. 051),明显低于对照组和空白转染组(P <0. 05);si-UBE2T组培养第1 d、3 d和6 d吸光度值均低于对照组和空白转染组(P <0. 05);对照组和空白转染组培养第1d、3d和6d吸光度值比较差异无统计学意义(P> 0. 05);si-UBE2T组细胞迁移率和穿膜细胞数分别为(0. 322±0. 040)%和(85. 12±12. 06)个,明显低于对照组和空白转染组(P <0. 05);对照组和空白转染组UBE2T蛋白相对表达量、细胞迁移率和穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 UBE2T基因表达可促进鼻咽癌5-8F细胞增殖、侵袭及转移,有望成为鼻咽癌分支靶向治疗的靶标。

SLUG基因可调控性干扰载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的 探讨鼻咽癌细胞中基因表达,构建可调控性相关基因干扰载体,并验证其干扰作用。方法 将高转移人鼻咽癌细胞株5-8F、5-8F-H3细胞进行培养,实时荧光定量RT-PCR检测5-8F及5-8F-H3细胞中SLUG、CBX3、MAD2L1、PLAU、HMGA1基因的表达水平。应用酶切、连接技术构建pSUPERIOR-SLUG干扰载体,采用脂质体转染方法转染5-8F-H3细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效果。结果 5-8F及 5-8F-H3细胞中SLUG基因表达水平均明显高于CBX3、MAD2L1、PLAU、HMGA1基因(均P<0.05),相对倍数分别为(11.23±1.78)倍、(1.23±0.17)倍、(1.57±0.27)倍、(6.36±0.38)倍、(3.66±1.14)倍,以SLUG基因倍数最高。所构建的pSUPERIOR-SLUG重组质粒,经酶切鉴定及序列分析证实为所需的目标序列,并成功转染鼻咽癌5-8F-H3细胞。阳性克隆S2-18基因表达水平高于阳性克隆S1-7、S1-9、S2-22基因(P<0.05),干扰率分别为67.42%、72.45%、84.20%、75.61%。结论 SLUG基因在鼻咽癌5-8F-H3中高表达。成功构建了重组质粒——pSUPERIOR-SLUG,并成功转染鼻咽癌5-8F-H3细胞,为后续进一步研究SLUG在鼻咽癌的作用奠定了基础。

MTA1沉默抑制鼻咽癌转移能力的体外研究

目的探究MTA1基因敲除后对鼻咽癌细胞株5-8F细胞转移能力的影响。方法设计并构建针对MTA1基因的RNAi片段,脂质体(LipofectamineTM2000)介导Si-MTA1-01(Si-MTA1-01组)和Si-MTA1-02(Si-MTA1-02组)感染5-8F细胞,同时设无义序列转染组(Si-ctr组)为对照。应用荧光定量PCR和蛋白印迹法检测转染后各组细胞的MTAl mRNA和蛋白表达;细胞划痕实验、基底膜侵袭实验和细胞黏附实验检测转染后5-8F细胞迁移和侵袭能力的变化,并进行比较分析。结果与Si-ctr组相比,Si-MTA1-01和Si-MTA1-02组MTA1 mRNA及蛋白表达水平下降,穿膜细胞数减少,细胞黏附率增加(均P<0.05),划痕实验显示细胞阻滞效果明显。结论沉默MTA1能明显减弱鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力,MTA1有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

姜黄素通过调控Tiam1蛋白表达影响鼻咽癌增殖与侵袭的研究

通过观察Tiam1蛋白在鼻咽癌组织中表达情况,探究姜黄素对鼻咽癌5-8F细胞增殖及侵袭的影响。通过免疫组化法检测发现鼻咽癌组织中Tiam1表达高于鼻咽黏膜慢性炎症组织;CCK-8实验、划痕实验及Transwell实验结果说明,姜黄素可体外抑制5-8F细胞的增殖及迁移能力;Western blot检测不同浓度处理5-8F细胞后Tiam1蛋白表达情况。本研究证实Tiam1在鼻咽癌组织中高表达;姜黄素可能通过抑制Tiam1蛋白表达,降低5-8F细胞增殖与侵袭能力。