5-Aza-CdR通过Notch1通路对小鼠海马神经发生的影响

目的研究5-Aza-CdR对Notch1通路影响及神经再生的影响,并通过小鼠主动回避行为实验来探讨5-Aza-CdR对小鼠学习记忆能力的影响。方法将60只6~8周龄SPF级ICR雄性小鼠分为两组,通过侧脑室注射(i.c.v)给一组小鼠注射5-Aza-CdR,另一组注射BSA作为对照组。注射后24 h通过Real-time PCR和Western blot检测Notch1和HES1的mRNA和蛋白表达水平;通过激光共聚焦显微镜观察5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞和海马DG中Notch1的表达;用MS-PCR检测Notch1甲基化变化;通过穿梭回避实验来评估小鼠的学习和记忆行为。结果注射5-Aza-CdR使海马Notch1通路活性增加并促进DG区神经细胞再生,降低Notch1启动子区甲基化水平,小鼠主动回避行为能力得到提升。结论5-Aza-CdR对小鼠主动回避行为的影响可能与Notch1通路影响海马神经再生有关。

5-Aza-CdR联合EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用

目的:探讨EB病毒核抗原1(EBNA1)mRNA修饰的DC(EBNA1-DC)诱导的淋巴细胞联合甲基化抑制剂5-Aza-CdR对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用。方法:以构建的EBNA1-pCDNA3.1质粒为模板,体外转录获得EBNA1 mRNA,通过脂质体转染至健康人外周血来源DC,构建EBNA1-DC疫苗。流式细胞术检测转染后DC表型及5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况。实时无标记动态细胞分析技术检测EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞联合5-Aza-CdR的特异性抗肿瘤活性。结果:转染EBNA1 mRNA后EBNA1-DC表面EBNA1阳性率为(59.3±5.85)%,HLA-DR的表达与未转染DC相比显著升高[(84.9±5.5)%vs(68.0±5.8)%,P=0.026],CD80的表达也显著升高([88.2±3.9)%vs(61.1±4.4)%,P=0.015]。低剂量5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况与未处理的细胞相比无显著差异。经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞中IRF7基因表达与未处理的细胞相比显著升高(P=0.0001)。与空载的DC相比,EBNA1-DC诱导的淋巴细胞对EBV阳性表达的C666-1细胞具有更强的特异性杀伤活性(P=0.049);经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞对EBNA1-DC诱导的特异性免疫杀伤更敏感(P=0.019)。结论:5-Aza-CdR与EBNA1-DC疫苗联合可显著增强对C666-1细胞的特异性免疫杀伤,本研究为开拓以mRNA为基础的DC疫苗及其在临床综合治疗中的应用转化提供前期研究基础。

启动子甲基化对抑癌基因转录的影响及其5-Aza-CdR干预作用的研究

目的在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株水平观察基因启动子CpG岛甲基化与mRNA转录之间的关系,探讨5AzaCdR(5azaeoxycytidine)的干预作用。方法应用甲基化特异性的多聚酶链反应(MSP)和RTPCR分别检测甲基化的发生和mRNA的转录水平。结果细胞株A549甲基化的基因为MGMT、RASSF1a,SH77甲基化的基因为MGMT、RASSF1a和RARβ,NCl甲基化的基因包括APC和RARβ。4个抑癌基因发生甲基化的细胞株mRNA均不转录,而经5AzaCdR处理后均恢复转录。结论NSCLC细胞株中抑癌基因启动子甲基化导致mRNA转录失活,5AzaCdR具有潜在的去甲基化作用使基因恢复转录。

5-Aza-CdR对胶质瘤细胞生长及LRRC4基因异常甲基化的影响

LRRC4是一个新发现的胶质瘤抑瘤基因,它在多种胶质瘤细胞系和胶质瘤组织表达缺失或下调,前期研究结果表明胶质瘤细胞和组织中LRRC4的编码区未发生突变、缺失或重排.为了获得LRRC4作为胶质瘤抑瘤基因的进一步证据,采用去甲基化制剂5-Aza-CdR处理LRRC4表达缺失的SF126和SF767胶质瘤细胞,MSP和RT-PCR检测表明,LRRC4的启动子在表达缺失的SF126和SF767细胞存在完全的甲基化,而5-Aza-CdR能逆转LRRC4启动子的甲基化状态,恢复LRRC4的表达.MTT法测定显示,5-Aza-CdR使SF126和SF767胶质瘤细胞增殖受到明显抑制,并呈时间和剂量的依赖性.同时流式细胞仪检测显示,5-Aza-CdR使SF126和SF767胶质瘤细胞周期阻滞于G0/G1期.因此,5-Aza-CdR能抑制胶质瘤细胞SF126和SF767增殖并干扰其细胞周期,LRRC4启动子异常甲基化是其在胶质瘤细胞中表达缺失的重要机制,5-Aza-CdR能逆转LRRC4基因的甲基化,恢复LRRC4的表达,为LRRC4作为胶质瘤去甲基化治疗的靶标提供了科学依据.

5-Aza-CdR对乳腺癌MCF-7细胞增殖及抑癌基因RASSF2A表达的影响

目的研究5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对乳腺癌MCF-7细胞增殖及抑癌基因RASSF2A表达的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7细胞12-96h,四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法和流式细胞仪分别检测药物处理前后细胞的增殖活性和凋亡率;实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各阶段RASSF2A mRNA的表达水平,甲基化特异性PCR（MSP）观察该基因甲基化的改变。结果用1、5、10μmol/L 5-Aza-CdR处理MCF-7细胞24、48、72和96h后,细胞生长均受到抑制,呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明,3种药物浓度处理细胞72h后凋亡率增加,5和10μmol/L组凋亡率分别为（25.5±3.5）%和（58.2±3.2）%,与对照组（13.4±2.0）%相比差异有统计学意义（P〈0.05）。RT-PCR检测显示,不同浓度药物处理MCF-7细胞后,RASSF2A mRNA表达水平随着药物浓度的增加而逐步上调;进一步MSP检测发现这些癌细胞中RASSF2A甲基化状态得到了不同程度的逆转。结论 5-Aza-CdR可通过逆转RASSF2A基因异常甲基化导致该基因表达上调来抑制MCF-7细胞增殖,RASSF2A是一个乳腺癌相关抑癌基因。

5-Aza-CdR与低浓度CDDP联合用药对胃癌细胞系生长及DAPK1的影响

目的研究5-Aza-CdR与低浓度CDDP联合用药对胃癌细胞系生长及DAPK1的影响。方法选择CDDP(1×10-6 mol/L)与1×10-6 mol/L的5-Aza-CdR分别处理体外培养的BGC823细胞与SCG7901细胞,5-Aza-CdR与CDDP联合处理体外培养的细胞后,用MTT法检测药物处理后的细胞增殖活性;RT-PCR法检测用药前后细胞中DAPK1的mRNA表达的变化。结果与单独用药组比较,胃癌细胞在药物联合作用组生长增殖活性明显被抑制。联合用药组DAPK-1基因的mRNA表达明显增加。结论 5-Aza-CdR与CDDP联用对胃癌细胞的生长抑制具有协同作用。

5-Aza-CdR对胃癌细胞系p27kip1基因异常甲基化的影响

目的探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞系SGC7901的p27kip1基因异常甲基化及表达的影响。方法选择不同浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的SGC7901细胞后,用MSP法检测用药前后细胞中p27kip1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测用药前后细胞中p27kip1的mRNA及蛋白表达的变化。结果 p27kip1基因的甲基化状态得到了逆转,p27kip1基因的mRNA和蛋白表达得到增加。结论 SGC7901细胞中p27kip1基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关。

5-Aza-CdR诱导肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达

目的:探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原表达的诱导作用。方法:常规培养人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株H2P和MHCC97-H、人结肠癌细胞株HT-29和LoVo及人脑胶质瘤细胞株U251,RT-PCR和免疫细胞化学法检测5-Aza-CdR作用前后肿瘤细胞中NY-ESO-1 mRNA和蛋白的表达。结果:RT-PCR与免疫细胞化学检测仅见胃癌SGC-7901细胞阳性表达NY-ESO-1,其余5株肿瘤细胞不表达NY-ESO-1。NY-ESO-1阴性的肝癌细胞株H2P、结肠癌细胞株LoVo及脑胶质瘤细胞株U251经5-Aza-CdR(终浓度分别为1、5和10μmol/L)处理6 d后,细胞形态和生长速度均无明显改变,而NY-ESO-1 mRNA和蛋白均被诱导为阳性表达,并随5-Aza-CdR浓度增加而阳性表达逐渐增强。结论:5-Aza-CdR能诱导肝癌、结肠癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原的表达,为肿瘤免疫治疗提供了一条新思路。

5-Aza-CdR可提高TRAIL对胃癌细胞Kato3的抗瘤活性

目的 探讨 5 Aza CdR对TRAIL抗胃癌细胞活性的影响。方法 采用MTT方法检测TRAIL的抗癌活性 ;采用RT PCR方法检测Caspase 8基因mRNA的表达。结果 未经 5 Aza CdR处理者只有 2 0 %胃癌Kato 3细胞对TRAIL敏感 ,经 5 Aza CdR处理可诱发Caspase 8mRNA的表达 ,提高Kato 3细胞对TRAIL的抗瘤敏感性。 结论 5 Aza CdR可提高TRAIL对胃癌细胞的抗瘤作用 ,其机制可能与诱发Caspase

DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰的牛胎儿成纤维细胞的作用

以转AID基因细胞和AID基因敲减细胞为研究对象,旨在探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对其细胞形态、细胞周期、相关基因表达及其基因启动子区甲基化状态变化的影响。此外,还分析了整体基因组去甲基化和位点特异性去甲基化之间存在的差别,探讨提高体细胞重编程效率的方法及其作用机制。通过Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)、Western blotting和流式细胞术等技术分析了5-Aza-CdR对转AID基因细胞和AID基因敲减细胞的影响。结果表明,5-Aza-CdR对转AID基因细胞的影响存在明显的剂量效应,浓度为4μmol/L时,具有明显的细胞毒性,大量细胞死亡(P<0.05)。当使用处理浓度为1-3μmol/L时,细胞形态发生改变,细胞增殖被抑制。核型分析显示,3μmol/L浓度组处理就可以导致转AID基因细胞出现异常核型。使用1μmol/L浓度处理细胞,明显增加了表达报告基因细胞的数量,细胞AID和SOX2的表达量都有所提高,并且SOX2基因启动子区的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR处理AID基因敲减细胞后,OCT4和SOX2的表达量较对照组明显升高,而NANOG却没有发生变化。结果显示,5-Aza-CdR处理转AID基因细胞可改变细胞形态、细胞周期和报告基因的表达,5-Aza-CdR处理后基因组整体去甲基化和AID基因的位点特异性去甲基化协同作用于体细胞重编程。

5-Aza-2’-CdR对K562细胞甲基化酶及miR-146a、miR-29b表达的影响

目的观察甲基化酶抑制剂5-Aza-2’-CdR作用后K562细胞中miR-146a及miR-29b的表达水平变化及DNMT1、DNMT3a、DNMT3b三种甲基化酶水平的改变。方法 MTT法检测5-Aza-2’-CdR作用于K562细胞时的IC50浓度。通过茎环引物法及荧光定量PCR的方法检测miRNAs以及甲基化酶的水平。结果 5-Aza-2’-CdR作用于K562细胞时的IC50浓度随药物作用的时间不同而异。药物作用后72h进行检测,凋亡细胞比例上升,miR-146a、miR-29b的水平较对照组升高,而DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的水平与对照组相比呈降低的趋势,DNMT3a在11μM 5-Aza-2’-CdR处理72h后虽表现出了升高的趋势,但差异无统计学意义。结论 5-Aza-2’-CdR能促进K562细胞的凋亡,5-Aza-2’-CdR作用后miR-146a、miR-29b表现出了上升的趋势而三种甲基化酶表达水平有所降低。

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响。方法不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化。结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P<0.05)。结论去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力。

5-AZA-CdR联合EGCG对HL-60和K562的影响

目的探讨细胞因子INFα和甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA-CdR)能否诱导HL-60和K562 Xaf1表达,以及Xaf1表达诱导剂联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否具有协同抗癌作用。方法(1)1000U/mlINFα和不同剂量的5-AZA-CdR作用于HL-60和K56248h,通过RT-PCR检测Xaf1和XIAP mRNA的表达并比较差异。(2)最佳Xaf1表达诱导剂联合EGCG作用于白血病细胞,流式细胞技术检测Bcl-2家族成员、线粒体膜电位和细胞凋亡的情况。结果(1)随5-AZA-CdR剂量增加,HL-60和K562Xaf1 mRNA表达增加,INFα也能诱导Xaf1表达,以5-AZA-CdR(5μmol/L)的作用最强;INFα和5-AZA-CdR均不影响XIAP mRNA的表达。(2)5-AZA-CdR和EGCG可改变HL-60和K562细胞Bcl-2(Bcl-xl)和Bax的表达,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡,二者联合作用被加强。结论(1)INFα和5-AZA-CdR能诱导HL-60和K562Xaf1 mRNA的表达,且5-AZA-CdR的作用具有剂量依赖性。(2)5-AZA-CdR和EGCG在体外能诱导白血病细胞凋亡,并具有协同效应。

5-Aza-CdR激活肝癌细胞Runx3基因表达及其临床意义

目的:通过检测肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中Runx3基因启动子区域甲基化状态,探讨肝癌细胞系经药物5-Aza-CdR处理后Runx3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的药物新靶点。方法:采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝细胞癌细胞系Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测,用药物5-Aza-CdR2μmol/L处理肝癌细胞HepG23d,继续常规培养5d后,RT-PCR检测Runx3 mRNA表达情况,利用集落形成实验观察细胞的生长活性,应用显微镜观察细胞形态及凋亡变化。结果:在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;肝癌细胞HepG2经5-Aza-CdR处理后,HepG2细胞检测出Runx3基因重新表达,细胞克隆形成率显著降低,显微镜观察显示部分细胞体积缩小、形态趋于规则及凋亡细胞明显增多。结论:Runx3基因启动子区域甲基化可能是导致Runx3基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效激活Runx3基因重新表达,抑制肝癌细胞生长,诱导部分肿瘤细胞凋亡。

5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706,并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化,FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化,RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达,免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后,超甲基化状态解除,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率明显提高(P<0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强,同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P<0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mR-NA表达,当其超甲基化解除后,细胞增殖受到抑制,同时细胞凋亡率相应提高。

5-Aza-CdR对德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育效果的影响

为了探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对德保黑猪手工克隆(HMC)重构胚胎体外发育效果的影响,本研究分别从供体细胞和重构胚入手,比较了5个不同处理浓度(0、5、10、20和40nmol/L)5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理浓度;在最佳浓度下比较5个不同处理时间(0、24、48、72和96h)对HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理时间;用4个不同浓度(0、0.25、0.5和1μmol/L)5-Aza-CdR结合最佳浓度和最佳时间处理供体和重构胚,比较其体外发育潜能。结果显示,与空白对照组相比,5、10、20和40nmol/L5-Aza-CdR处理72h对重构胚卵裂率均无显著差异(P>0.05),20nmol/L 5-Aza-CdR处理能显著提高重构胚的囊胚率(P<0.05),10和20nmol/L 5-Aza-CdR处理均能显著提高囊胚细胞数(P<0.05),其中以20nmol/L 5-AzaCdR效果最佳;与空白对照组相比,利用20nmol/L 5-Aza-CdR处理HMC重构胚72h能显著提高重构胚的囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05),其余处理时间对重构胚卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响(P>0.05);在囊胚的最佳处理浓度(20nmol/L)和最佳处理时间(72h)下,结合供体的4个处理浓度(0、0.25、0.5和1μmol/L),同时处理重构胚和供体,各处理组HMC重构胚的发育潜能均有提高,但效果均不显著(P>0.05),其中0.25～0.5μmol/L 5-Aza-CdR处理效果较佳。综上表明,适宜浓度(0.25～0.5μmol/L)的DNA甲基化酶抑制剂5-AzaCdR处理供体细胞72h并结合20nmol/L 5-Aza-CdR处理重构胚72h均能有效提高德保黑猪HMC重构胚胎的体外发育潜能,该结果可为今后研究德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化调控机制提供参考。

5-Aza-CdR对人喉鳞癌Hep2细胞凋亡及蛋白质表达的影响

目的:探讨5-Aza-CdR对人喉鳞癌Hep2细胞凋亡及蛋白质表达的影响。方法:Hep2细胞分别经10-7mol/L 5-Aza-CdR和DMSO处理72h,应用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测5-Aza-CdR对Hep2细胞凋亡的影响。抽提各组Hep2细胞总蛋白质,行双向电泳,采用PDQuest-7.0.1软件及MALDI-TOF质谱技术筛查5-Aza-CdR对Hep2细胞蛋白表达的影响,并通过Western blot对显著性差异蛋白质进行验证。结果:人喉鳞癌Hep2细胞在10-7mol/L 5-Aza-CdR处理72h后出现明显的细胞核致密浓染,Hep2细胞的凋亡率由对照组的(2.70±0.28)%增加到(13.96±0.41)%,具有统计学意义(P<0.05)。双向电泳筛查了包括S100A4在内的5种表达显著差异的蛋白质,Western blot进一步验证了5-Aza-CdR能明显上调喉鳞癌Hep2细胞中S100A4的表达,进而证明了双向电泳结果的可信性。结论:5-Aza-CdR介导的Hep2细胞部分蛋白质表达改变,直接或间接地参与了5-Aza-CdR诱导的Hep2细胞凋亡的发生,为5-Aza-CdR在喉鳞癌探讨性治疗中的机制研究奠定基础。

5-Aza-CdR对肺癌SPC-A1细胞生长及p16基因异常甲基化的影响

目的:观察5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对体外培养的肺癌SPC-A1细胞增生、细胞周期及其对此细胞株中p16基因的甲基化状态的影响。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理体外培养肺癌SPC-A1细胞后,用MTT法检测药物处理24、48、72h后的细胞增殖活性;PI染色和流式细胞仪检测药物处理72h后的细胞周期分布;MSP法检测用药前后细胞中p16基因的甲基化状态;RT-PCR法检测用药前后细胞中p16的mRNA表达变化。结果:2×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L 5-Aza-CdR处理肺癌SPC-A1细胞24、48、72h后,细胞增生受到抑制,有时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明,不同药物浓度处理肺癌SPC-A1细胞72h后细胞增殖指数降低明显:5×10-6、1×10-5mol/L组分别为(34.65±0.52)、(28.29±0.79),与对照组(43.85±1.17)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。在5-Aza-CdR处理前未检测到肺癌SPC-A1细胞系的p16基因的mRNA表达,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因在肺癌SPC-A1细胞系中甲基化状态得到了逆转,p16基因的mRNA重新表达。结论:5-Aza-CdR对肺癌SPC-A1细胞具有增生抑制作用;p16基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关。

5-Aza-CdR对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株中RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞株中RASSF1A基因启动子区域甲基化状态及其表达的影响。方法不同浓度的5-Aza-CdR对HXO-RB44细胞进行化学干预72h后用无药物完全培养基培养72h,MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR对于HXO-RB44细胞的生长抑制率;甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变;RT-PCR观察RASSF1A基因mRNA水平变化;Western blot检测RASSF1A蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡。结果 0.5μmol.L-1、1.0μmol.L-1、2.0μmol.L-1和5.0μmol.L-1的5-Aza-CdR对HXO-RB44细胞的生长抑制率分别为(9.37±3.53)%、(25.72±2.35)%、(39.88±4.32)%和(76.50±0.94)%,各组之间差异具有统计学意义;经5-Aza-CdR干预后,RASSF1A基因启动子区域由高甲基化状态转变为非甲基化状态,仅0.5μmol.L-15-Aza-Cd就可逆转RASSF1A基因的高甲基化状态;RT-PCR和Western blot结果显示在干预组细胞中分别出现RASSF1A基因的DNA条带(329bp)和蛋白质条带(相对分子质量39×103),而对照组中没有相应条带出现;各组之间RASSF1A mRNA以及蛋白的表达差异均具有显著性统计学意义;流式细胞术显示药物处理后细胞周期出现G0/G1期阻滞,并出现显著的细胞凋亡。结论 DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR能够诱导RASSF1A基因启动子区域去甲基化,并通过该机制诱导RASSF1A基因在人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44中的表达。

5-Aza-CdR对MDA-MB-231细胞PPAR-γ基因甲基化的影响

目的研究去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶(5-aza-2.-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞MDA-MB-231凋亡及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)基因表达的影响。方法 5-Aza-CdR作用MDA-MB-231细胞后,流式细胞术检测MDA-MB-231细胞凋亡,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantive PCR,q PCR)检测PPAR-γ m RNA的表达,甲基特异性PCR(methylmion specific PCR,MSP)检测PPAR-γ甲基化的改变。结果流式细胞结果表明,随着药物浓度增加,细胞处理48 h后,凋亡率增加,呈剂量依赖性。5、10、15和20μmol/L组凋亡率分别为(14.1±2.3)%、(25.4±3.3)%、(32.7±2.8)%、(43.1±1.9)%,与对照组的(6.9±0.8)%相比差异有统计学意义(P<0.05);q PCR结果显示,随着药物浓度增加,PPAR-γ m RNA表达上调;MSP显示PPAR-γ甲基化水平降低。结论 5-Aza-CdR能降低PPAR-γ甲基化状态,使PPAR-γ表达增加,促进MDA-MB-231细胞凋亡。PPAR-γ甲基化水平改变可能是引起MDA-MB-231细胞生物学改变的机制之一。