静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的:探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与皮肤创面愈合的情况。方法:以SD大鼠为研究对象,分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型;经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞,于不同时间点(3、7、14、21、28天)观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性;经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率>90%;标记后的干细胞进行移植4周后,实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集,对照组中未发现明显的聚集现象。结论:5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的:探讨经5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法:分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。将大鼠背部脊柱一侧作为实验组并制作一全层皮肤缺损模型,其对侧为对照组,经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107个。术后3天、7天、14天、21天、28天分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14天后大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗5-BrdU/FⅧ、5-BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠对侧正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论:5-BrdU标记的BMSCs参与皮肤创面愈合。

体外冲击波结合自体5-BrdU标记骨髓间充质干细胞移植治疗骨不连的实验研究

目的在体外成功分离培养标记兔骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的基础上,观察体外冲击波疗法(Extracorporeal shock wave therapy,ESWT)结合自体BMSCs移植治疗骨不连的疗效。方法制作兔骨不连模型并根据干预方式不同随机分为4个组:冲击波结合干细胞组,干细胞组,冲击波组,完全对照组。定期拍片测量骨折间隙宽度变化(2周、6周、10周)、免疫组化观察,10周后比较愈合率。结果标记后的干细胞移植6周后,在冲击波结合干细胞组、干细胞组骨痂中可见(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记的阳性细胞聚集,冲击波组和对照组中未发现明显的聚集现象;冲击波结合干细胞组干预后6周、10周,与其它各组骨不连间隙差异有显著性;10周后冲击波结合干细胞组骨不连愈合效果好,与其他各组统计学上差异有意义。结论移植的自体干细胞可能参与了骨不连的成骨,结合冲击波的微动力学刺激,有利于骨折的愈合,有望成为一种较好的骨不连治疗方法 。

差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的探讨以5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。在大鼠背部脊柱一侧制作全层皮肤缺损模型,实验组经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107。对照组为5-BrdU标记的BMSC移植的正常大鼠。术后3d、7d、14d、21d、28d分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14d后,大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗BrdU/FⅧ、BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论经尾静脉注射移植的BMSCs参与皮肤创面愈合。

芪棱汤对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠5-BrdU蛋白表达的影响

目的：探讨芪棱汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠5-Brdu蛋白表达的影响。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组、芪棱汤去养阴药组及芪棱汤组。采用颈内动脉线栓加环扎法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO＼Reperfusion）。在再灌注后不同时间点采用免疫组化法检测5-BrdU蛋白表达。结果：芪棱汤去养阴药汤组与芪棱汤组5-BrdU蛋白表达明显多于模型组（P〈0．05），且芪棱汤5-BrdU蛋白表达明显多于芪棱汤去养阴药汤组（P〈0．05）。结论：芪棱汤能够促进5-Brdu蛋白表达，其可能通过刺激内源性神经干细胞增殖达到神经保护作用。

胸腺嘧啶和5-溴脱氧尿嘧啶诱导小鼠白血病细胞同步化

目的；用胸腺嘧啶和５－溴脱氧尿嘧啶联合作用小鼠红白血病细胞，建立白血血病细胞同步化方法。方法：参照遗传学人外周血细胞同步化方法，细胞生长状态好的加入胸腺嘧啶，培养一定时间后加入５－溴脱氧尿嘧啶培养４．５－５小时后加入积水仙素，常规制备中期染色体标本，根据分裂相的多少了解同步化的效率。结果：经诱导后可获得大量中期染色体分裂相。

脂多糖抑制海马神经前体细胞增殖

目的探讨脂多糖(LPS)对大鼠海马齿状回(DG)的神经发生的影响及机制。方法大鼠腹腔注射LPS(1 mg/ml)后,用免疫组织化学方法检测海马DG的颗粒下层5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)的阳性细胞和诱发的钙接头蛋白分子Iba1蛋白的表达;用免疫荧光双标的方法检测BrdU和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、双皮质醇(DCX)的共表达;新生大鼠海马分离培养神经干细胞,采用免疫细胞法检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达,检测LPS对神经前体细胞分化的影响和LPS受体Toll样受体(TLR)4的表达。结果LPS能使青少年雄性大鼠发育迟缓,体重增长延迟;急性抑制成年大鼠DG区的神经发生。结论LPS可能通过激活TLR4途径抑制神经前体细胞的增殖。

胃癌组织中标记滞留细胞的初步鉴定

目的研究裸鼠胃癌组织中标记滞留细胞的存在及其分布特点。方法培养人胃癌细胞株BGC-823,5-BrdU标注后接种于裸鼠右腋窝皮下。于接种后10、20、28、35、42、49、56d处死裸鼠,取其右腋下肿瘤结节进行免疫组化检测。结果实验组接种后第10天,裸鼠肿瘤组织中标记滞留细胞(LRCs)表达最高,达到96.14%,随着时间的增加,LRCs逐渐降低,到第80天在肿瘤中仅有极少量细胞表达BrdU,约占0.51%,主要位于癌巢的边缘部位,细胞形态与BrdU阴性细胞无明显的差异。结论胃癌BGC-823细胞株在裸鼠体内形成的肿瘤内存在标记滞留细胞,这部分细胞与肿瘤干细胞密切相关,可能在维持肿瘤生长、转移、复发方面发挥重要作用。

施万细胞长期植入中枢神经系统后存活及迁移的实验研究

目的观察施万细胞长期移植入中枢神经系统后是否存活。方法取大鼠施万细胞体外培养,一部分经5'溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后移植至电针损伤的大鼠中脑网状结构,另一部分经Hoechst33342标记后置于PLGA支架内再移植至大鼠全横断脊髓损伤处,分别于移植后的8个月和11个月处死动物,行BrdU免疫组织化学染色及荧光显微镜观察。结果施万细胞移植入脑内8个月后仍可见较多BrdU阳性细胞,褐色椭圆形,并向大脑皮层迁移;移植于脊髓11个月后荧光显微镜下可见许多Hoechst33342阳性细胞,发蓝色荧光,形态不规则,在PLGA支架内及其头、尾端脊髓实质内都可见到。结论施万细胞移植入中枢神经系统后可长期存活,并向远端迁移。

原代培养大鼠松果体细胞的增殖与分化——免疫组织化学研究

目的 探讨体外培养大鼠松果体细胞的生长、增殖及分化。方法 采用 MTT测定法、Brd U及 5 - HT免疫组织化学方法。结果 相差显微镜观察可见培养的松果体细胞呈小圆形或不规则形 ,初期聚集成巢 ,以后逐渐分散贴壁 ,有强折光性 ,细胞体积随培养时间的延长而增大。MTT检测证实 ,培养的松果体细胞增生较活跃 ,细胞倍增时间在培养第 9天 ,第 11天左右达高峰。 Brd U免疫组化法对松果体细胞分裂与增值的观察及统计结果与 MTT检测结果相符。 5 - HT阳性细胞占培养细胞总数的 80 %以上。结论 体外培养能获得生长增殖旺盛、具有一定生理功能的松果体细胞。

BrdU和EGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞的对比研究

目的:研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)和腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的最佳标记时间与剂量,并进行比较。方法:密度梯度离心分离大鼠骨髓MSCs并体外扩增。AdCMV-EGFP分为100、200、400及800 particles/cell四组进行转染;BrdU以终浓度5、10、15μmol/L进行标记。分别于实验第1、3、5、7 d检测两种方法对MSCs的标记率。通过MTT检测两种标记方法对细胞增殖活性的影响。结果:AdCMV-EGFP以100 par-ticles/cell转染未引起MSCs凋亡,转染3d时效率最高(44.4±3.5%);BrdU以10μmol/L、标记3 d的标记率为(75.1±3.1)%。两种方法均不影响细胞增殖。结论:AdCMV-EGFP和BrdU均可高效标记MSCs,根据研究需要不同均可作为高效的MSCs标记方法。

BrdU抗血清制备和应用的研究——Ⅱ.应用BrdU抗体技术显示BrdU标记的染色体和DNA

使用高度特异的BrdU抗血清,通过酶标第二抗体和DAB-H_2O_2或AEC-H_2O_2显色法,成功地显示了CHO和人染色体的BrdU标记区域。使用同样的程序和方法亦成功地显示了硝酸纤维膜上pg水平的BrdU-DNA印迹点。

IGF-1对缺血性脑损伤大鼠脑内神经发生的影响

目的:建立大鼠单侧局灶脑缺血模型,观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对局灶脑缺血后的鼠脑神经发生及增殖后细胞生存的影响。方法:用健康雄性SD大鼠建立大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,随机分成假手术组,缺血对照组和IGF-1治疗组。各组再按不同的治疗时间分为7d、14d、28d、42d组。免疫组化法观察BrdU、PSA-NCAM的变化,免疫双标法观察BrdU/PSA-NCAM、BrdU/MAP_2和BrdU/GFAP的共同表达变化。结果:BrdU标记细胞和PSA-NCAM标记细胞计数均在缺血后第7d最多,分别是缺血对照组的4.0倍和1.8倍。是假手术组的9.9倍和5.4倍。BrdU和PSA-NCAM双标细胞在缺血发生后双侧SVZ和DG区可以检测到,于第7d计数最多,之后逐渐降低;而BrdU和MAP_2以及BrdU和GFAP双标细胞却从第14d开始逐渐增多,直到第42d。随着BrdU/PSA-NCAM双标阳性表达的逐渐降低,BrdU/MAP_2双标阳性表达逐渐增高,呈现此消彼涨的变化。结论:IGF-1侧脑室注射后,在早期(7d内)诱导了缺血性脑损伤后神经细胞的增殖;在中期(7d-14d)诱导了新生细胞的迁移;在后期(14d后)伴随着迁移的进行新生细胞逐渐发生了分化。

低分子量肝素抑制球囊损伤后兔血管内膜增生的实验研究

目的:探讨不同剂量、不同给药时间低分子量肝素(LMWH)对兔髂动脉内膜损伤后内膜增生和血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:将96只纯种雌性家兔分为空白对照组6只(A),实验对照组18只(B)、小剂量(60u/Kg)LMWH组36只(C)、大剂量(120u/Kg)LMWH组36只(D)。根据不同给药时间,C、D组分别分成三个亚组。三组均经左侧股动脉,近心端插入3FFogarty球囊导管,反复拉动导管制备髂动脉内膜损伤模型。分三批于用药后72h、14d和28d提取髂动脉标本;利用计算机成像系统测量内膜厚度,抗SMCα-ActinABC免疫组织化学方法行5-BrdU单抗标记和Verhoff方法联合测定SMC增殖指数。结果:A组内膜厚度平均41.35±7.06μm;未见5-BrdU标记的阳性细胞。B、C、D组内膜厚度均明显高于A组(P<0.01)。C、D组的内膜厚度和SMC增殖指数高于B组,有显著性差异(P<0.05),并可见5-BrdU标记的阳性细胞。C和D组比较,前者的内膜厚度和SMC增殖指数均小于后者,但两者间无统计学差异,P>0.05。结论:兔髂动膜球囊导管损伤后,内膜明显增生,平滑肌细胞增殖;LMWH可抑制其血管内膜增生和平滑肌细胞增殖,尤其是小剂量、损伤后早期用药。

用BrdU法检测外周血淋巴细胞hprt突变的方法学探讨

目的 探索用 5 -溴脱氧尿嘧啶 (5 bromodeoxyuridine,BrdU)法检测次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 (hypoxanthine guaninephosphoribosytransferasegene,hprt)突变的操作程序。 方法 用正交设计法就BrdU法的最佳检测条件进行了探讨。结果 本研究所得的最佳操作程序是 :将血样放入 4℃冰箱中冷藏2 4h ;培养基中 6 巯基鸟嘌呤 (6 thioguanine ,6 TG)最终浓度为 1×10 -4mol/L ;BrdU最终浓度用1× 10 -4mol/L ;加入BrdU后培养时间为 16h ;Giemsa染液浓度为 4 % ;染色时间为 15min。结论 BrdU法是一种较好的检测hprt突变的方法。

意大利蜜蜂工蜂脂肪体胚后发育过程中细胞的增殖和凋亡

脂肪体是昆虫体内物质贮备和中间代谢的重要组织。本研究通过显微形态观察、BrdU免疫组织化学和原位末端转移酶标记(TUNEL)细胞凋亡检测技术,对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂脂肪体胚后发育过程中细胞的增殖和凋亡特点进行了比较研究。结果表明:意大利蜜蜂工蜂脂肪体细胞数量的快速增加集中在幼虫发育前期(1-3龄),而细胞的凋亡则集中在蛹发育早期的2-3 d(预蛹-2日龄蛹)时间之内。在变态发育中,工蜂幼虫脂肪体凋亡降解后重新组建形成成虫的脂肪体。本研究为昆虫脂肪体的功能研究以及昆虫组织细胞自噬和凋亡的机制研究提供一定的证据。

中华蜜蜂上颚腺的组织结构及其胚后发育

【目的】上颚腺(mandibular gland)是昆虫重要的外分泌腺,它产生的化学物质在昆虫的种内信息交流中起重要的作用。本研究目的在于了解中华蜜蜂Apis cerana cerana上颚腺的组织结构以及胚后发育特点。【方法】本研究通过组织形态学、BrdU免疫组织化学等技术,对中华蜜蜂上颚腺的结构和发育过程进行了比较研究。【结果】中华蜜蜂的上颚腺在不同级型间差异显著,蜂王的面积最大,工蜂较小,而雄蜂退化。上颚腺出现在末龄幼虫到预蛹阶段,细胞分裂活动的高峰期发生在蛹发育的第1天,随后分裂细胞数减少,并一直持续到蛹发育的第6天结束。在上颚腺发育早期,由分泌细胞分化的内膜就已经出现,并一直保持到成虫。【结论】本研究为昆虫上颚腺的发育和功能研究提供了理论基础。

豚鼠前庭椭圆囊器官在庆大霉素损伤后离体培养的细胞增殖

目的 在离体状态下对豚鼠前庭椭圆囊器官进行培养,观察庆大霉素损伤毛细胞后细胞的增殖情况。方法采用白色健康豚鼠36只,体重300-450克,随机分为4组:(1)正常对照组;(2)正常加BrdU(5-溴基脱氧尿核苷BrdU)组;(3)庆大霉素组;(4)庆大霉素加BrdU组。应用体外组织培养、5—溴基脱氧尿核苷(BrdU,3μg/ml)掺入及免疫组织化学染色和Epon树酯包埋半薄切片等方法,在不同时间(2、3、5、15天)光镜观察庆大霉素(2.0mM)损伤后毛细胞及支持细胞增殖情况。结果 用庆大霉素48小时后,可见到椭圆囊感觉上皮中的毛细胞溶解破坏。加入BrdU继续培养,BrdU免疫组织化学染色显示了第5和15天被BrdU标记的阳性细胞核,阳性细胞核多位于椭圆囊感觉上皮中基底层,从细胞的形态和分布位置上看为支持细胞;感觉上皮的表层,也可观察到BrdU反应阳性的上皮细胞,细胞核较圆,形态和位置类似毛细胞。结论 提示损伤后的椭圆囊感觉上皮支持细胞可以进行细胞的有丝分裂,支持细胞可能是修复毛细胞的前体细胞。

“综合修复法”在BrdU免疫组化染色中的应用

目的探讨Brdu免疫组织化学染色的最佳修复方法。方法采用不同的抗原修复方法:酶修复,pH6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复或微波修复,pH 9.0 Tris-EDTA高压修复或微波修复,以及0.1%Triton X-100/0.1%柠檬酸钠渗透及胰酶增加细胞膜的通透性、冷0.1mol/L盐酸去除染色体组蛋白、2mol/L盐酸使DNA双链变性、四硼酸钠重建碱性环境的"综合修复法",对小鼠BrdU标记的嗅上皮组织进行免疫组织化学染色。结果经"综合修复"后,免疫组化染色敏感性较其他修复方法明显增强,并且准确定位优于其他方法(P<0.01)。结论在BrdU的免疫组化染色中,"综合修复法"是较理想的抗原修复方法。