5-azaC对萝卜茎尖DNA甲基化和开花的影响

本文研究了去甲基化因子5氮杂胞苷(5azaC)对萝卜开花及幼苗茎尖DNA甲基化水平的影响。用0(对照)、0.10、0.25、0.50和1.00mmolL5azaC处理‘短叶13’萝卜种子6d,除对照外,茎尖组织DNA甲基化水平均有所降低,并与春化后茎尖组织DNA甲基化水平相当;茎尖组织DNA甲基化水平随着处理浓度的提高而下降。同时,5azaC处理明显促进春性品种萝卜‘短叶13’的开花。结果表明5azaC可以部分代替低温诱导萝卜开花。

5-azaC对HSG细胞增殖抑制的实验研究

目的:研究5-azaC对HSG细胞的作用,为5-azaC治疗涎腺肿瘤提供理论和实验基础。方法:通过体外生长曲线测定和体内移植实验检测5-azaC对HSG细胞的增殖抑制作用。结果:体外实验表明5-azaC可以抑制HSG细胞的增殖,5×10-6mol/L和10×10-6mol/L5-azaC对HSG细胞的增殖抑制率分别为85%和92%。与对照组相比,用5-azaC处理HSG细胞后再移植到裸鼠皮下,其致瘤性降低。结论:体内、体外实验表明5-azaC能抑制HSG细胞的增殖。

5-AzaC对表皮干细胞Oct4基因的诱导作用研究

目的：探讨并建立表皮干细胞Oct4基因的非转基因诱导方法。方法：分离培养人表皮干细胞,在培养至3-5d出现克隆性生长时加入工作浓度为10μmol/L的5-AzaC,24h后再诱导1次。采用RT-PCR方法,检测经5-AzaC刺激48h后的表皮干细胞Oct4基因转录水平。结果：PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,出现247bp（Oct4）和219bp（β-actin）目的片段明亮的特异性条带。结论：5-AzaC能有效激发出表皮干细胞Oct4基因的转录。

DNA甲基化抑制剂5-azaC对花椰菜生长发育的影响

研究了不同浓度DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)处理不同熟性花椰菜(青花和白花)的幼苗对现蕾时间等田间生长发育指标的影响。结果表明:一定浓度的5-azaC不仅能促进花椰菜提前现蕾和开花,而且对株高、株幅、花球直径、单球质量等生长指标均有影响,影响大小与浓度密切相关。同一材料在不同浓度5-azaC条件下花椰菜现蕾时间存在显著差异,各处理的现蕾时间均比对照明显提前,现蕾时间可提前3~8 d,适宜的5-azaC浓度为10~20 mg/L。不同材料对5-azaC处理的敏感反应程度不同,低浓度5-azaC(5~20 mg/L)处理表现为促进作用,高浓度5-azaC(20~40 mg/L)处理表现为抑制作用。

5-azaC处理对低温弱光胁迫下黄瓜幼苗抗氧化酶活性的影响

为了研究5-azaC处理与植物耐冷性机理之间的关系,本实验以黄瓜幼苗为试材,研究了不同浓度5-azaC处理对低温弱光(10℃/6℃,300(μmol/m^2)/s)胁迫下黄瓜幼苗抗氧化酶活性的影响。结果表明:与对照相比,喷施500~800μmol/L的5-azaC处理可以显著降低幼苗叶片内MDA含量(P<0.05),在低温24 h时分别降低了19.45%、19.83%,低温48 h时分别降低了12.19%、16.20%;提高SOD、CAT、APX和GR抗氧化酶活性,有效降低了黄瓜幼苗在低温弱光胁迫下活性氧(H_2O_2和O_2^-)的产生和积累;但随着浓度的升高,1000~5000μmol/L的5-azaC处理导致黄瓜叶片膜脂过氧化产生,使抗氧化酶活性显著降低,导致植物产生氧化损伤。

5-azaC对小麦幼苗生长及盐胁迫后DNA甲基化变异的影响

DNA甲基化是调节植物生长发育,调控逆境基因表达的表观遗传机制之一。该研究采用不同浓度的DNA甲基化抑制剂5-azaC处理耐盐性不同的春小麦种子,分析其对种子萌发及盐胁迫后叶片基因组DNA甲基化的影响,探究DNA甲基化与小麦耐盐性之间的相关性。结果表明:(1)5-azaC显著抑制幼苗根长伸长,降低根系鲜重和干重。(2)甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析发现,单独盐胁迫后甲基化水平上升,5-azaC预处理材料经盐胁迫后甲基化水平呈下降趋势。(3)盐胁迫后基因组同时发生DNA去甲基化和DNA甲基化。敏盐品种‘新春6号’DNA去甲基化比率上升,DNA甲基化增加的比率下降;耐盐品种‘新春11号’DNA去甲基化比率和DNA甲基化增加的比率均上升,但去甲基化比率大于DNA甲基化增加的比率,说明盐胁迫引起的基因组DNA去甲基化为主,5-azaC预处理提高了盐胁迫下DNA去甲基化的比率。(4)DNA甲基化修饰位点序列分析发现,在核糖体亚基蛋白、蛋白激酶和转座子序列均存在DNA甲基化修饰现象,说明存在多种代谢途径共同参与了盐胁迫调控。

5-azaC对‘巨峰’葡萄果实发育阶段mRNA可变剪接的影响

DNA甲基化和mRNA可变剪接在果实发育过程中均发挥重要作用,但两者间的联系和互作关系尚不清楚。基于5-氮杂胞苷(5-azaC,DNA甲基转移酶抑制剂)处理可以使‘巨峰’葡萄成熟期提前,对5-azaC处理后的‘巨峰’RNA-seq测序,分析果实不同发育阶段发生的可变剪接事件。结果表明,3′端可变剪切位点(A3)类型在处理和对照中均最多,外显子互斥(MX)类型最少。可变剪接在不同发育阶段存在特异调节,发育前期可变剪接的调控更为频繁;鉴定到9683个发育过程中保守的可变剪接事件。在处理与对照间有671个可变剪接事件存在明显的剪接变化,功能注释显示其中有14个基因与甲基化修饰相关,表明可变剪接与甲基化修饰协同调控葡萄果实成熟过程。

5-氮杂胞苷对苦瓜果实成熟及转录表达谱的影响

【目的】研究5-氮杂胞苷(5-azaC)对苦瓜果实成熟和基因表达模式的影响,为解析苦瓜果实成熟的分子调控机制提供理论依据。【方法】以苦瓜(Momordica charantia L.)高世代自交系E12201-e1为材料,利用50 mmol/L 5-azaC处理绿熟期(授粉后18 d)苦瓜果实,以ddH2O处理为对照,观察处理组(TR)和对照组(CK)果实的表型变化,并利用RNA-seq技术比较TR和CK苦瓜果肉组织中的转录水平差异。【结果】50 mmol/L 5-azaC处理能明显延迟苦瓜果实成熟。RNA-seq获得的数据质量较高,可满足后续分析需求。通过筛选共获得1773个差异表达基因(DEGs),其中1007个上调基因,766个下调基因。GO和KEGG分析结果表明,DEGs主要富集在细胞组分和分子功能模块,217个DEGs共富集到93条代谢通路中,其中30个DEGs显著富集到光合作用和苯丙烷类生物合成通路。8个DEGs参与细胞壁代谢过程,其中6个基因在5-azaC处理中下调表达。共获得681个差异表达转录因子(TFs),分属于220个TF家族。12个DEGs的qRT-PCR结果与RNA-seq结果变化趋势一致。【结论】5-azaC处理抑制苦瓜果实成熟,并影响果实成熟相关基因的表达模式。

5-氮胞苷对HSG细胞的诱导凋亡作用

目的体外研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-azaC)对起源于人颌下腺闰管的HSG(human salivary gland,HSG)细胞的诱导凋亡作用,为应用5azaC对涎腺肿瘤进行治疗奠定理论和实验基础。方法用不同浓度的5-azaC处理HSG细胞,观察5-azaC在非毒性浓度下,能否诱导HSG细胞发生凋亡。结果加入5-azaC后48h,光镜下可见到少数细胞体积缩小,胞浆向外突起,类似出芽及发泡状;琼脂糖凝胶电泳结果显示经5-azaC作用72h的基因组DNA呈现出"梯状"图像,基因组DNA被内切酶切成了180bp～200bp及其整倍数的片断;流式细胞仪检测结果显示细胞在G1期前面出现亚二倍体峰;透射电镜结果显示5-azaC处理组细胞可见核内凋亡小体;免疫组化结果显示5-azaC可以抑制P53、Bcl-2和FAP-1的表达;Western blot结果显示5-azaC处理后可使FAP-1的表达降低。结论5-azaC在体外能诱导HSG细胞凋亡。

5-氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响

以小麦(Triticumaestivum L.)品种周98165为材料,对5-azaC处理前后的幼苗形态及生长指标进行了研究,并采用AFLP和MSAP技术对其遗传稳定性和DNA甲基化变化作了初步探讨.结果表明,一定浓度(5～50μmol/L)的5-azaC不仅能使小麦的分蘖能力有所提高,而且还影响抽穗和花期、千粒重等指标,100μmol/L以上的5-azaC对小麦根和苗的生长有显著的抑制效应.AFLP分析表明,不同浓度5-azaC处理之间未见明显差异片段,5-azaC处理过程中材料基因组碱基序列保持一致,未发生变异.运用MSAP技术分析了5-azaC处理前后样品的甲基化水平,与对照相比,5-azaC处理后的材料均产生了不同程度的甲基化变化,其中去甲基化条带占总变异带的60%以上.DNA去甲基化的程度随5-azaC剂量的增大而提高,且不同浓度处理引起的甲基化变化的模式基本一致.

5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

目的:研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响。方法:密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞,磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养,DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azaC)处理。分别提取DNA、RNA和蛋白质。亚硫酸氢钠处理DNA,巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌,挑取克隆测序。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测穿孔素mRNA的表达,Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化。结果:5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组(P<0.05)。测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低,与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高,这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。

5-氮胞苷对贵州小型猪淋巴细胞DNA损伤及修复的影响

目的 研究贵州小型猪淋巴细胞对化学物或药物引起的DNA损伤及修复影响的反应。方法 用单细胞凝胶电泳技术检测比较 5 氮胞苷对PHA刺激和未刺激淋巴细胞的DNA损伤及其修复过程。结果 5 氮胞苷引起未刺激淋巴细胞明显的DNA泳动 (彗星尾 ) ,经修复孵育 2h后 ,DNA泳动与孵育前比较无显著差异 ,而 5 氮胞苷引起的刺激细胞DNA泳动经 2h修复孵育后与孵育前比较显著减少。结论 5 氮胞苷引起贵州小型猪未刺激淋巴细胞DNA损伤经 2h孵育未能修复 ,而刺激细胞的DNA损伤明显修复。

17β-雌二醇联合5-氮胞苷上调前列腺癌22RV1细胞p75NTR表达并促进凋亡的研究

目的探讨17β-雌二醇(E2)联合DNA去甲基化试剂5-氮胞苷(5-AzaC)对雄激素非依赖性前列腺癌22RV1细胞生长抑制和凋亡的影响及作用机制。方法应用17β-E2和/或5-AzaC处理前列腺癌22RV1细胞,并检测细胞生长抑制率、凋亡率以及雌激素受体2(ESR2)和p75神经生长因子受体(p75NTR)的表达情况。结果 17β-E2或5-AzaC呈时间及浓度依赖性抑制22RV1细胞增殖,17β-E2和5-AzaC 48hIC50分别是0.2μmol/L和4.0μmol/L。17β-E2(0.2μmol/L)+5-AzaC(4.0μmol/L)对22RV1细胞的增殖抑制及凋亡表现出协同作用,17β-E2或5-AzaC均能上调ESR2和p75NTR的mRNA及蛋白的表达,且联合应用时效果更明显。结论联合应用17β-E2和5-AzaC上调ESR2和p75NTR的表达可能是雄激素非依赖性前列腺癌治疗的一个潜在的治疗策略。

5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响

目的探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响。方法应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10μmol/L、20μmol/L和50μmol/L3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢。结论启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一,5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态,从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长。

17β-雌二醇联合5-氮胞苷对前列腺癌细胞22RV1增殖、侵袭迁移能力的影响及其机制

目的探讨17β-雌二醇(17β-E2)联合DNA去甲基化试剂5-氮胞苷(5-AzaC)对雄激素非依赖性前列腺癌细胞22RV1增殖、侵袭迁移能力的影响及其机制。方法应用17β-E2和/或5-AzaC处理前列腺癌22RV1细胞,MTT法检测其对细胞增殖抑制的影响,并计算增殖抑制率;划痕愈合实验和Transwell实验检测其对细胞体外迁移、侵袭能力的影响;Western blot法检测雌激素受体2(ESR2)和侵袭转移相关蛋白表达的变化。结果 17β-E2和5-AzaC对前列腺癌22RV1细胞的增殖均具有不同程度的抑制作用,且呈时间依赖关系,联合用药效果明显增强(P<0.05);经17β-E2或5-AzaC处理后前列腺癌22RV1细胞体外迁移及侵袭能力均降低,且联合应用时效果更明显(P<0.05),并伴随ESR2表达的上调,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、MMP-9)、p-AKT表达的下调。结论联合应用17β-E2和5-AzaC能明显抑制前列腺癌22RV1细胞的增殖、侵袭迁移能力,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路相关,联合应用17β-E2和5-AzaC调节ESR2、MMP-2、MMP-9的表达可能是抑制雄激素非依赖性前列腺癌转移的有效方法。

5-氮杂胞苷对低温胁迫下黄瓜幼苗光合作用的影响

为探究降低基因组DNA甲基化水平在低温条件下对黄瓜幼苗光合作用的影响,以‘津研四号’黄瓜幼苗为试材,研究了不同浓度DNA甲基化抑制剂5-aza C处理对低温(10℃/6℃,300μmol·m^(-2)·s^(-1))胁迫下黄瓜幼苗叶片气体交换参数、叶绿素荧光猝灭、细胞膜透性的影响。结果表明:低温条件下,500~800μmol·L^(-1)的5-aza C处理能够显著降低黄瓜幼苗叶片细胞膜透性(P<0.05);提高叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr),降低胞间CO_2浓度(Ci);同时也促进PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)的升高,非光化学猝灭系数(NPQ)和叶片光化学猝灭参数[Y(NO)]的降低,从而提高黄瓜幼苗的耐冷性。

^(137)Cs-γ辐照及5-氮杂胞苷处理毛竹种子对其实生苗甲基化水平的影响

为了研究药物和辐照对毛竹甲基化水平的影响,采用0、25、50、100、250μmol·L-1的5-氮杂胞苷和0、10、20、30、40、60、90、120 Gy的^(137)Cs-γ射线分别处理毛竹种子,并利用高效液相色谱技术,采用外标法测定实生苗叶片的甲基化水平。结果表明,5-氮杂胞苷处理毛竹种子后,甲基化水平下降,其中250μmol·L-1处理后甲基化水平为20.8%,下降最显著;低剂量的辐照处理对甲基化的影响不明显,而在高剂量的γ射线胁迫下,DNA甲基化程度下降至26.0%,达到极显著水平。本研究揭示了辐照与基因组甲基化水平间的相关性,为毛竹辐照诱变和甲基化抑制育种提供了科学依据。

5-氮胞苷与2,4-D处理对龙眼早期体胚发生及DlAGOs表达的影响

表观遗传过程,如DNA甲基化,在调控植物的生长发育和体细胞胚胎(SE)的正常发生中起着关键作用。植物体细胞胚胎发生是一个细胞分化与器官形态建成的过程,植物体细胞胚胎发生体系可作为研究胚胎发育特别是早期胚胎发育的良好替代体系。本研究利用植物体细胞胚胎发生体系分析了DNA甲基化水平对龙眼球形胚发生的影响,并采用实时荧光定量技术检测了不同浓度5-氮胞苷(5-azac)与2,4-D处理下龙眼Argonaute基因家族(DlAGOs)的相对表达水平。结果发现:(1)当2,4-D浓度为0.1 mg/L时,对照组以及5-azac浓度为5和25μmol/L的处理组均有球形胚产生,而5-azac浓度为25μmol/L处理组中龙眼球形胚更典型,数量更多;(2)2,4-D浓度为0.5 mg/L时,只有5-azac为5μmol/L处理组中有球形胚产生;(3)DlAGOs在不同浓度5-azac和2,4-D处理下具有不同的表达模式,5-azac浓度为5μmol/L能显著诱导DlAGO4的表达。这些研究结果表明,5-azac作为甲基化抑制剂,适宜浓度的5-azac能抑制2,4-D的甲基化作用,降低龙眼胚性愈伤组织的DNA甲基化水平,促使龙眼球形胚提前发生,同时,DNA甲基化水平降低能够促进DlAGO4的表达。以上的研究结果为龙眼体胚发生过程中的DNA甲基化机制研究奠定了理论基础。

DNA甲基化抑制剂作用机理及其在植物发育生物学研究中的应用

本文综述了DNA甲基化抑制剂作用机理及其在植物发育生物学研究中的应用。DNA甲基化抑制剂使甲基基团不能转移到腺嘌呤或胞嘧啶,导致DNA甲基化反应受阻,从而使基因组甲基化水平降低。DNA甲基化抑制剂已被用于因DNA甲基化引起的植物表观遗传研究中,同时它可以代替低温促进植物提早开花,并可能在植物性状改良中得到进一步的研究和应用。

DNA去甲基化试剂处理对青花菜春化作用的影响

以早熟品种清风103和中熟品种绿秀为试材,采用5-氮胞苷(5-azaC)不同施用方式处理,研究DNA去甲基化对青花菜春化作用和春化过程中植株体内C/N的影响。结果表明,叶面喷施5-azaC处理可明显促进青花菜春化及花芽分化,且植株体内全糖/全氮、可溶性糖/可溶性蛋白、蔗糖/可溶性蛋白的值均高于5-azaC根施处理和清水、清水+吐温对照。不同熟性品种春化启动所需的时间不同,中熟品种比早熟品种需要更长的启动时间。