5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响

目的观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P16基因mRNA表达。MTT法观察细胞生长速度,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率。结果 P16基因在人结肠癌细胞系Caco-2中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,P16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达。CpG岛去甲基化后能明显地抑制细胞的生长,诱导细胞凋亡,影响细胞周期分布,并具有良好的量效依赖关系。结论 5-Aza-CdR能够逆转P16基因甲基化状态,调控P16基因表达并有效地抑制肠癌细胞增殖。

5-脱氧杂氮胞苷抑制肝癌细胞株生物学行为的机制

目的 DNA甲基化模式的改变伴随着永生性细胞系的确立,生长调控基因CpG岛的重新甲基化可能导致了其转录的不活跃,在体外培养的情况下,使得肿瘤细胞选择了有利于生长的条件,我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷处理两株肝癌细胞,研究其对肝癌细胞的影响,探讨DNA甲基化异常与肝细胞癌间的相关性及5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株恶性生物学行为的影响及其机制。 方法 用5-脱氧杂氮胞苷处理肝癌细胞株SMMC-7721和HePG2,然后采用相差显微镜观察药物处理前后细胞的形态变化,采用MTT法观察细胞的生长速度变化,采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率、P16蛋白表达的变化,采用RT-PCR法比较p16和甲基转移酶mRNA表达量的变化,比较裸鼠致瘤性的大小。 结果 5-脱氧杂氮胞苷处理后细胞形态趋于规则,生长速度减慢,SMMC-7721细胞,G1期细胞增加了8.5％,而S期和C_2/M朗细胞分别减少了47.8％和10.4％,HePG2细胞,G_1期细胞增加了3.5％,S期减少了46.2％,G_2/M期增加了23.7％,两细胞凋亡率分别增加了91.6％和133.3％,P16蛋白表达分别增加了23.4％和20.9％,p16 mRNA表达增高,而DNA甲基转移酶mRNA表达明显降低,裸鼠皮下移植瘤生长减慢。 结论 肝细胞癌的发生与DNA甲基化异常有关,甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可能通过抑制甲?

MTR基因Rs1805087多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究

目的研究5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase,MTR)SNPs位点Rs1805087多态性与非综合征性唇腭裂的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法,检测174例非综合征性唇腭裂患者和169例正常对照组的MTR基因Rs1805087的多态性。结果 MTR基因Rs1805087位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡;MTR基因Rs1805087位点基因型及等位基因的分布在NSCL/P组与对照组之间均无统计学意义(P>0.05)。结论结果未显示MTR基因Rs1805087多态性与非综合征性唇腭裂的发生有关。

5-氮脱氧胞苷及曲古抑菌素A影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性及浓度依赖性

目的:探讨甲基转移酶抑制剂——5-氮脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dC)和组蛋白去乙酰基酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性和浓度依赖性。方法:用不同浓度5-aza-dC及TSA按不同作用时间处理供核细胞(鼠尾尖成纤维样细胞),利用实时定量PCR法检测处理后H19基因的表达。结果:不同浓度的5-aza-dC处理组之间H19的表达无明显差异,但延长作用时间可使H19表达增强;TSA使H19的表达下降,但无时间依赖性。结论:长时间低浓度的5-aza-dC能增强供核细胞中H19基因的表达,而TSA则使H19的表达减弱,为体细胞克隆中表观遗传修饰抑制剂的选择及后续基因印迹研究提供了依据。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对人甲状腺乳头状癌细胞DNA甲基化及DAPK基因表达的影响

目的探讨DNA甲基化在甲状腺乳头状癌中的作用机制,使用去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷酸(5-Aza-CdR)对死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因表达水平的影响。方法将10μmol/L的去甲基化制剂5-Aza-CdR分别应用于人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株及人正常甲状腺Nthy-ori-3细胞株,Real-timePCR和Westernblot法检测用药前后DAPK、DNA甲基转移酶(DNMTs)mRNA和蛋白的表达情况。结果Real-timePCR结果显示,与人正常甲状腺细胞相比,人甲状腺乳头状癌中DNMTsmRNA高表达;人甲状腺乳头状癌细胞应用5-Aza-CdR治疗后,DNMTsmRNA的表达量减少,而DAPK的mRNA表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05);Westernblot结果显示,与人正常甲状腺细胞相比,甲状腺乳头状癌中DNMTs蛋白的表达高,DAPK蛋白表达少,经5-Aza-CdR作用48h后,DNMTs蛋白表达降低,DAPK蛋白表达升高(P<0.05)。甲状腺正常细胞中不论给药前后,DAPK及DNMTs的mRNA及蛋白表达均无差异。结论DNA甲基化在甲状腺乳头状癌中扮演重要的角色,5-Aza-CdR可能通过调节DNMTs的mRNA及蛋白的表达使沉默的DAPK基因恢复表达,从而发挥对甲状腺乳头状癌的防治作用。

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。

老年PAOD同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变频率的研究

目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、胱硫醚β合成酶(CBS)基因844ins68、甲 硫氨基合成酶(MS)基因A2756G三种同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关酶基因突变在北京社区汉族老年周围动脉闭 塞性疾病(PAOD)发病中的意义。方法:PCR扩增老年PAOD83例及100例老年健康对照的MTHFR、CBS、MS基 因突变点,直接或经限制性内切酶消化后行凝胶电泳确定基因型。结果:老年PAOD病例组MTHFR基因中,T/T基 因型占34.9%,明显高于老年健康对照组的19%(P<0.01);C/C占13.3%,明显低于老年健康对照组的31% (P<0.01);C/T与老年健康对照组无明显差异(P>0.05)。老年PAOD病例组MTHFR等位基因T突变位点的频 率占60.8%,明显高于老年健康对照组的44%(P<0.01)。CBS844ins68、MSA2756G各种基因型频率和等位基因 频率在老年PAOD病例组和老年健康对照组之间无差异。结论:在北京社区汉族老年人群中,MTHFR等位基因 C677T突变可能是老年PAOD独立的遗传性危险因子,而CBS基因844ins68、MS基因A2756G的突变可能不足以 成为遗传危险性。

无锡女性MTHFR和MTRR基因多态性研究

目的分析无锡女性叶酸代谢相关基因MTHFR与MTRR的基因多态性分布特征。方法对无锡市524名育龄妇女,采集口腔黏膜上皮细胞,提取基因组DNA,用荧光定量PCR方法对MTHFR与MTRR基因多态性位点进行检测分析,了解无锡市妇女MTHFR与MTRR基因单核苷酸位点多态性(SNP)的分布频度,并与山东、河南、广东、海南等地区进行比较。结果无锡地区妇女MTHFR C677T位点多态性分布与山东、河南、广东、海南地区数据比较差异均有统计学意义(P均<0.05);MTHFR A1298C位点等位基因C出现频率低于等位基因A,与广东、海南地区数据比较差异均有统计学意义(P<0.01)。MTRR A66G位点多态性的分布与山东、河南、广东等地区数据比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论无锡地区女性MTHFR基因多态性分布具有地区特异性。

卒中后认知障碍与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性关系研究

目的:探索卒中后认知障碍(PSCI)与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的关系。方法:选取急性卒中患者200例,其中6个月内发生认知障碍的患者100例作为痴呆组,6个月内未发生认知障碍的患者100例作为未痴呆组,另选取同期体检结果呈健康的健康体检者200例为正常对照组。采集所有研究对象外周血检测MTHFR及5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶还原酶(MTRR)基因型多态性,全自动化学发光免疫分析仪检测血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平。结果:痴呆组患者血浆Hcy水平明显高于未痴呆组(P<0.05);未痴呆组患者血浆Hcy水平明显高于对照组(P<0.05);痴呆组A1298C位点基因型AA、AC和CC、C677T位点基因型TT、CT和CC和A66G位点基因型AA、AG和GG的分布频数与未痴呆组和对照组比较具有统计学差异(均P<0.05);既往卒中史(OR=1.721,P=0.040)、卒中部位(OR=1.828,P=0.047)和血浆Hcy水平(OR=1.839,P=0.042)为卒中后发生PSCI的独立影响因素。结论:MTHFR及MTRR基因多态性与卒中后认知障碍的易感性和临床特症存在相关性,可作为筛选标志物。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷、曲古抑菌素A联合化疗对人胃癌细胞生长及MGMT基因表达的影响

目的探讨体外5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-AzadC)、曲古抑菌素A(TSA)联合5-氟尿嘧啶(5-FU)和紫杉醇(PTX)对人胃癌SGC-7901细胞生长及6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因表达的影响。方法将培养的SGC-7901细胞分为八组:对照组、5-FU+PTX组、5-AzadC组、TSA组、5-AzadC+TSA组、5-AzadC+5-FU+PTX组、TSA+5-FU+PTX组和5-AzadC+TSA+5-FU+PTX组。用MTS法测定各组药物对SGC-7901细胞生长的影响,RT-PCR和Western blot方法检测SGC-7901细胞MGMT mRNA及其蛋白的表达。结果 5-AzadC、TSA、5-FU+PTX均能抑制细胞生长,且呈时间依赖性,多药联合组较单药组抑制率增强(P<0.05);加药72h后多药联合组较单药组MGMT mRNA和蛋白表达增强(P<0.05)。结论 5-AzadC、TSA、5-FU+PTX及药物联合干预通过增强MGMT基因再表达而抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长。

急性白血病/骨髓增生异常综合征患者DNA甲基转移酶亚型的表达

目的 探讨DNA甲基转移酶 (DNMTs)亚型与急性白血病 (AL)发病及骨髓增生异常综合征 (MDS)向AL转化的关系。方法 半定量逆转录 (RT) PCR技术测定 75例AL/MDS患者的DNMT1、3A及 3B的mRNA表达水平。结果 低危MDS组 (2 1例 )DNMT各亚型的表达升高与正常对照组平均值无统计学差异 ,但以正常对照组平均值的 80 %单侧上界为界 ,则分别为 4 7 6 %、4 7 6 %和 4 2 9% ,高于正常对照 (P <0 0 1)。高危MDS组 (13例 )分别为 5 3 8%、76 9%和 92 3%高于正常对照 (P <0 0 1) ,其中DNMT 3B表达显著高于低危MDS组 (P <0 0 1) ,而DNMT1和 3A表达与低危组差异无显著性。AL组 (41例 )DNMT1、3A及 3B分别为 92 7%、97 6 %和 10 0 %高于正常对照 (P <0 0 1) ,且三种DNMT亚型表达水平均显著高于MDS组 (P <0 0 1)。急性淋巴细胞白血病组DNMT1表达显著高于急性髓细胞白血病组 (P <0 0 1) ,而二组的DNMT3A ,3B表达无统计学差异。结论 DNMTs表达水平的增高与AL的发病及MDS向AL转化过程密切相关 ,并以DNMT3B的关系最为密切。

双氢青蒿素对前列腺癌PC-3细胞中UCHL1基因表达的调控机制研究

目的 :研究双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人前列腺癌PC-3细胞株中抑癌基因泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1,UCHL1)表达的影响,并探讨其可能的调节机制。方法 :PC-3细胞株经不同浓度(25、50和100μmol/L)的DHA处理48 h,并设空白对照组。采用FCM法检测各组细胞凋亡率和细胞周期的变化。采用免疫荧光染色法检测UCHL1和DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在细胞内的蛋白定位及表达量。蛋白质印迹法检测UCHL1、DNMT1、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)和Akt蛋白的表达;并且以1μmol/L磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)家族抑制剂Wortmanin作为阳性对照,比较分析DHA处理组p-Akt蛋白的表达量。结果 :DHA能明显诱导PC-3细胞凋亡,并使细胞停滞在G2/M期,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DHA处理组中DNMT1蛋白由细胞核转移到细胞质,与空白对照组比较,DNMT1蛋白在细胞核与细胞质中总的表达水平明显下调(P<0.05);而UCHL1蛋白表达在细胞质内明显上调(P<0.05)。与空白对照组比较,DHA处理组与阳性对照组的UCHL1蛋白表达均上调(P<0.05),DNMT1表达水平均下调(P<0.05),p-Akt蛋白表达水平下调(P<0.05),而Akt蛋白表达量无明显变化(P>0.05);其中,高浓度DHA处理组的p-Akt蛋白表达下调更为显著,更接近于阳性对照组。结论 :DHA能够抑制DNMT1的表达,恢复抑癌基因UCHL1的表达,从而诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡,阻滞细胞周期进程;推测其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活性有关。

亚砷酸钠对HaCaT细胞MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2、DNA甲基转移酶1、组蛋白去乙酰化酶-1结合的影响

目的观察亚砷酸钠（NaAsO：）对人肤角质形成细胞株（HaCaT细胞）MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2（MeCP2）、DNA甲基转移酶1（DNMTl）及组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）结合情况的影响，为深化阐释砷毒作用机制提供依据。方法分别以0．00（空白对照）、3．13、6，25、12．50、25．00μmol／LNaAs02重复间隔处理HaCaT细胞72h（NaAs02处理24h，隔天再次相同处理，重复3次），以人表皮鳞癌细胞株（A431）作为阳性对照。定量染色质免疫共沉淀技术（Q—CHIP）检测MGMT基因转录调控区CHIPl、CHIP2区域及MGMT基因编码区ChIP3区域MeCP2、DNMTl、HDACl结合情况。结果各组HaCaT细胞MGMT基因转录调控区CHIPl、CHIP2区域MeCP2、DNMTl、HDACl蛋白结合水平比较，差异有统计学意义（F值分别为7．387、84．634、78．442和19．263、69．649、26．546，P均〈0．05）；其中各N以s02处理组CHIPl、CHIP2区域MeCI〉2、DNMTl、HDACl蛋白结合水平[3．13μmol／LNaAs02处理组：（136．00±16．97）％、（145．00±2．83）％、（88．50±19．09）％和（106．50±37．48）％、（112．34±8．73）％、（59．71±8．49）％；6．25μmol／LNaAs02处理组：（130．00±42．43）％、（154．50士4．95）％、（101．00±1．27）％和（88．50±3．54）％、（134．32±2．82）％、（102．75±19．91）％；12．50~mol／LNaAs02处理组：（141．50±23．33）％、（161．50±7．78）％、（125．00±U．31）％和（119．50±24．75）％、（171．59±3．54）％、（167．61±10．61）％；25，00μmol／LNaAs02处理组：（134．50±43．13）％、（472．50±50．20）％、（383．50±30．41）％和（180．09±12．73）％、（348．50±27．58）％、（158．45±12．02）％]均高于空白对照组[（51．50±9．19）％、（82．00±12．73）％、（25．03±2．91）％和（37．02±4．24）％、（91．56±26．16）％、（19．09±2．90）％，P均〈0．05]。各组HaCaT细胞MGMT基因编码区CHIP3区域MeCP2蛋白结合水平比较，差异无统计学意义（F=1．670，P〉0．05），而DNMTl、HDACl蛋白结合水平比较，差异有统计学意义（F值分别为4．404、9．863，P均〈0．05），其中25．00I,Lmol／LNaAs02处理组DNMTl、HDACl蛋白结合水平[（615．85±29．63）％、（306．09±59．40）％]与空白对照组[（99．70±12．02）％、（92．45，±48．79）％]比较，差异有统计学意义（P均〈0．05）。结论MeCP2可结合于砷所致高甲基化MGMT基因转录调控区。通过招募DNMTl及HDACl使组蛋白去乙酰化，同时DNMTl可结合于MGMT基因编码区，以非甲基化DNA结合蛋白（IVIBD）依赖的方式招募HDACl，通过染色质重塑方式导致MGMT基因沉默，可能是砷毒性表现的早期分子事件。