CTL体外杀伤效应的特异性和敏感性影响因素的研究

目的 观察影响CTL体外杀伤效应的特异性和敏感性的主要因素。方法 抗原OVA免疫小鼠C5 7BL 6 ,取免疫后小鼠脾细胞 ,先用ELISPOT法检测CTL的活化 ,然后抗原肽OVA2 57- 2 6 4体外刺激免疫后的脾细胞 5d ,51 Cr释放法观察不同因素对CTL的体外杀伤效果的影响。结果 ELISPOT检测结果显示抗原免疫组产生了强CTL应答 ,而PBS免疫组没有应答。游离多肽的存在显著降低杀伤的效率 ,IL 2和Ficoll Hypaque离心去除死细胞可提高体外杀伤的效率。ConA的存在可以使CTL体外非特异的杀伤靶细胞。结论 CTL体外杀伤实验中必需尽量去除游离多肽 。

小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测

背景与目的:探索肝癌细胞的突变基因产物——具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理,寻找肝癌的特异性抗原,并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响。本实验构建BALB/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突细胞(dendriticcells,DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用。方法:采用RT-PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA,将该基因定向插入真核表达载体PEGF-N3中;同时培养经rmGM-CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞,体外获取大量DCs,脂质体转染PEGF-N3/AFP1、PEGF-N3/AFP2至DCs进行表达、鉴定。将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)分泌活性,51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果:从H22中克隆到AFP1cDNA和AFP2cDNA,经测序完全正确,所构建的真核表达质粒PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达,其中PEGF-N3/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)为5.12±1.46,明显高于空质粒组(1.42±0.73)。AFP2/DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[(88.15±16.47)%]明显高于空质粒组[(12.72±5.45)%]。结论:成功地构建了真核表达载体PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的PEGF-N3/AFP2转染的DC,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡。

人衰变加速因子在CHO细胞的表达及其衰变加速活性研究

目的 获得稳定表达人衰变加速因子 (humandecay acceleratingactivity ,hDAF)的中国仓鼠卵巢 (Chineseham sterovary ,CHO)细胞系 ,观察在补体活化情况下 ,hDAF对异种细胞的保护作用。方法 构建真核表达载体DAF pcDNA3 .1,用脂质体转染法将其导入CHO细胞 ,有限稀释法筛选稳定表达hDAF的单细胞克隆 ,流式细胞仪检测hDAF的表达 ,C3沉积实验和51 Cr释放法测定其促补体衰变活性。结果 成功构建了真核表达载体DAF pcDNA3 .1,并获得了表达hDAF的单细胞克隆 ,表达hDAF的CHO能减少补体C3的沉积 ,减弱补体的杀伤作用。结论 获得在细胞膜上稳定表达具功能活性的hDAF的CHO克隆 ,为进一步研究其结构与功能的关系准备了条件。

参芪扶正对肝癌化疗血浆免疫蛋白表达的影响及疗效观察

研究参芪扶正注射液对肝癌化疗患者免疫功能的影响及疗效观察。方法：132例原发性肝癌患者随机分为对照组和观察组，对照组患者给予动脉栓塞化疗，观察组患者在动脉栓塞化疗基础上静脉注射液参芪扶正注射液。分别于治疗前和疗程结束后，采用免疫散射比浊法测定患者外周血免疫球蛋白A（immunoglobulin，IgA）、G和M蛋白含量，流式细胞仪测定CD3、CD4＋、CDs细胞亚群数量，”CT释放法测定自然杀伤细胞（naturekill，NK）的活性；疗程结束后，采用RECIST1．1标准评价患者近期疗效，统计总有效率（RR）；治疗结束后每3个月进行随访1次，统计患者的2年无病生存率。于治疗前和治疗后，采用Karnofsky评分为标准评定患者生活质量改善情况，统计总改善率。结果：观察组患者淋巴细胞亚群CD3＋、CD4＋、CD4＋／cD8＋水平及NK细胞活性较治疗前和对照组显著升高（P〈0．05），CDs细胞水平显著降低（P〈0．05）；而对照组治疗后含量与治疗前差异无统计学意义（P〉0．05）。观察组总有效率显著高于对照组（80．65％VS56．45％，X2=4．308，P=0．038〈0．05）。观察组中位生存期为19．10个月（95％CI：15．418—22．782），对照组中位生存期为11．20个月（95％CI：9．71～12．294），差异有统计学意义（P〈0．05）。观察组患者生活质量总改善率显著高于对照组（85．48％VS51．6l％，）（X2=4．308，P=〈0．001）。且观察组白细胞减少、血红蛋白减少和血小板减少III—IV级不良反应发生率显著低于对照组（P〈0．05）。结论：参芪扶正注射液可以显著改善肝癌化疗患者免疫功能，提高患者预后，降低不良反应发生率。

转染肿瘤mRNA的树突状细胞疫苗诱导抗肝癌免疫研究

目的 探讨转染原发性肝癌(HCC)mRNA的树突状细胞(DC)能否诱导抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法 采用HCC患者外周血单核细胞(PBMC)体外刺激分化为DC细胞;从人肝癌HepG 2细胞和3例HCC患者的肝癌组织中体外扩增mRNA。以mRNA转染DC细胞,并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。流式细胞计数仪检测培养细胞中CD3 +、CD4+、CD8+细胞的比例。51Cr释放法测定CTL的杀瘤活性。结果 经扩增人肝癌HepG 2mRNA和2例AFP(+ )患者的AFP(+ )HCCmRNA诱导3周后,CD3 +、CD8+细胞占淋巴细胞总数由诱导前的2 7.8%、2 6.5 %、2 9.6%升高至89.3 %、73 .6%、86.8% ;而经扩增AFP(-)HCCmRNA诱导3周后,CD3 +、CD8+细胞占淋巴细胞总数由诱导前的2 5 .4%升高至5 3 .6%。转染HepG 2细胞和AFP(+ )的患者HCCmRNA的DC诱导的CTL对HepG 2细胞杀瘤活性明显高于AFP(-)的患者,其杀瘤特性由MHC I限制的CD8+T细胞所介导。结论 HCCmRNA体外转染DC能诱导肿瘤特异性CTL 。

树突状细胞与尤文肉瘤细胞融合诱导抗肿瘤免疫应答的体外研究

目的检测尤文肉瘤细胞A673和树突细胞(DC)融合构建的肿瘤疫苗对尤文肉瘤细胞株A673的杀伤作用。方法应用促融合剂PEG对尤文肉瘤A673细胞和从外周血单个核细胞(PBMC)诱生的树突细胞进行融合。利用细胞因子hGMCSF和hIL4从PBMC诱生DC,并对其表型进行流式细胞仪(FCM)分析,红色荧光染料PKH26标记A673细胞,绿色荧光染料PKH67标记DC,应用促融合剂PEG融合后光镜及电镜观察DC细胞和融合细胞形态,FCM检测融合效率,通过同种混合淋巴细胞反应检测其免疫刺激活性。通过IFNγELISA法产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的量,通过51Cr细胞杀伤试验检测融合细胞对A673细胞的杀伤作用。结果FCM检测出从PBMC成功诱生出CD83、CD80、CD86及HLADR高表达的成熟DC。DCs/A673融合细胞的融合效率达到23%,同种混合淋巴细胞反应显示DCs/A673融合细胞有很强的免疫刺激活性。IFNγ分泌检测显示DCs/A673融合细胞组较对照组产生CTL水平显著增高。51Cr释放法检测融合细胞体外诱导抗原特异的CTL,融合细胞激活的CTL对肿瘤细胞系A673细胞的杀伤作用强于DCA673混合组、DC组、A673组的CTL(P<0.05),作用较对照各组显著增强。结论DC与A673细胞融合体外致敏自体T淋巴细胞能生成抗原特异CTL对尤文肉瘤细胞A673有一定的杀伤作用。

自身免疫区域缺失的HCV核心基因仍能有效刺激产生抗核心蛋白的CTL

采用CTL进行免疫治疗，可能是清除慢性HCV感染的有效途径。虽然HCV核心基因高度保守，但先前的研究表明，HCV核心区可诱导自身免疫，其中氨基酸（aa）1-48以及aa178-187序列可分别诱导抗-GOR和抗-p450自身免疫CTL应答。HCV核心作为靶抗原使用前，应去除自身免疫刺激区。美国阿肯色医科大学Liu等构建了携带核心基因全长aa1-190或者截短的aa49—180（假-GOR和假-p450序列缺失）的两种重组腺伴随病毒（rAAV）载体，分别感染单核细胞／树突状细胞（DC），用PCR／DNA印迹、反转录PCR、流式细胞计量术、^51Cr释放法对AAV／核心的基因组整合、HCV核心mRNA的表达、AAV／核心病毒转导效率及HCV核心特异性CTL应答进行检测。