土壤中弓形虫半套式PCR检测方法的建立

根据NCBI上公布的弓形虫RH株的529bp基因序列(登录号:AF146527)用Primer Premier 5.0设计3条特异性引物TX1、TX2和TX3,建立土壤中弓形虫的半套式PCR检测方法,并将引物TX1与TX3扩增产物克隆到pMD18-T载体上进行测序.结果表明:该方法能扩增出约350bp的片段,TX1与TX3扩增片段约520bp,克隆到pMD18-T载体上的521bp片段与所选取的弓形虫RH株的目的基因序列相似性100%.该检测方法特异性强,以犬新孢子虫、牛微小隐孢子虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、牛链球菌、猪链球菌、蒙氏肠球菌基因组为模板均未扩增出条带;灵敏性高,检测极限为20fg弓形虫DNA;在22份土壤样品中检出3份阳性样品.

阿里红多糖对刚地弓形虫RH株速殖子体外感染小鼠腹腔巨噬细胞的影响

目的探索药用植物阿里红多糖(fomes officinalis polysaccharides,FOPS)粗提物对刚地弓形虫(toxoplasma gondii,Tg)RH株速殖子体外感染小鼠腹腔巨噬细胞及虫体增殖和凋亡的影响。方法CCK-8法计算FOPS粗提物对小鼠腹腔巨噬细胞的IC50并筛选安全药物剂量;建立刚地弓形虫RH株速殖子与小鼠腹腔巨噬细胞接种比例为1∶5的体外感染模型,分设空白对照组、强感染对照组和高(400μg/ml)、中(200μg/ml)、低(100μg/ml)剂量组。Hochest 33258荧光染色观察虫体感染小鼠腹腔巨噬细胞6 h、12 h、24 h、36 h、48 h形态及感染率变化;相对定量PCR法检测各实验组弓形虫529基因表达水平并计算虫体相对增殖抑制率;Annexin V-FITC结合流式细胞术检测感染10 h时高剂量(400μg/ml)FOPS对培养上清中游离弓形虫凋亡的影响。结果FOPS粗提物对小鼠腹腔巨噬细胞的IC50为1038μg/ml,安全药物剂量为519μg/ml以下。Hochest 33258荧光染色发现高剂量组感染6 h时细胞爬片中TgRH株速殖子无法侵入巨噬细胞且出现核固缩强亮荧光凋亡现象,12 h内感染率仅(5.38±3.08)%,显著低于感染对照组。各药物组巨噬细胞感染率在各时间均低于感染对照组。48 h时中、高剂量组巨噬细胞感染率分别为(85.31±2.33)%和(67.58±3.47)%,低于感染对照组的(92.51±2.88)%,差异有统计学意义(F=150.4,P<0.05);低剂量组巨噬细胞感染率为(91.96±2.31)%,与感染对照组相比差异无统计学意义(F=0.46,P>0.05)。弓形虫529基因表达水平显示感染48 h时高、中、低剂量FOPS的相对增殖抑制率分别为(75.70±0.03)%、(45.65±0.08)%和(38.98±0.06)%。流式细胞术检测高剂量H-FOP药物组感染10 h时细胞上清中TgRH株速殖子细胞周期发现G1期前典型亚二倍凋亡峰,占弓形虫总数的20.44%。结论FOPS可抑制刚地弓形虫TgRH株速殖子体外对小鼠腹腔巨噬细胞的感染和细胞内增殖,并在感染初期有抑制虫体入侵巨噬细胞、诱导虫体凋亡的作用。

复方一枝蒿颗粒抗小鼠急性弓形虫感染的实验研究

目的观察复方一枝蒿颗粒单用或联合阿奇霉素治疗小鼠急性弓形虫感染效果。方法通过腹腔注射弓形虫RH株速殖子的方法建立KM小鼠急性弓形虫感染动物模型,随机分成4组:急性弓形虫感染模型对照组、复方一枝蒿颗粒治疗组、复方一枝蒿颗粒与阿奇霉素联合治疗组,阿奇霉素对照组。观察小鼠病症及存活情况,采用ELISA法检测小鼠外周血弓形虫循环抗原CAg的表达变化;采用双基因PCR法检测弓形虫RH株速殖子在小鼠腹腔和脑、心、肺、肝、脾、肾等脏器中的增殖变化,并制备病理切片,染色后观察各脏器组织病理学变化。结果复方一枝蒿颗粒能够适当延长小鼠生存时间,延长率17.74%。组织学变化显示药物可减轻小鼠肺脏组织瘀血,并使小鼠脾脏出现大量多核型巨细胞形态。复方一枝蒿颗粒可抑制虫体在腹腔和肝、肾、心、肺组织中的增殖,感染4d时对小鼠腹腔冲洗液中游离速殖子的增殖抑制率可达92.80%,联用阿奇霉素增值抑制率达98.53%。相对定量PCR法显示弓形虫复方一枝蒿颗粒对小鼠肝、肾、心、肺组织中弓形虫增殖抑制率分别为(79.60±0.08)%、(42.00±0.20)%、(50.80±0.08)%、(60.40±0.21)%,作用虽弱于阿奇霉素对照组和联合药物组,但可显著抑制小鼠脑组织中弓形虫的增殖,增值抑制率达(76.80±0.07)%(F=63.08,P<0.01);核酸检测弓形虫529基因比B1基因在小鼠脏器中的表达更稳定,适宜作为弓形虫在宿主脏器组织中的监测指标。复方一枝蒿颗粒能降低虫体循环抗原CAg在感染小鼠外周血清中的表达水平,与感染组小鼠相比(3 970.82±20.52)pg/ml,至感染4d时药物组小鼠血清中CAg水平为(3 163.01±15.94)pg/ml。结论复方一枝蒿颗粒单用或联合阿奇霉素使用对小鼠急性弓形虫感染有一定治疗效果。与阿奇霉素对虫体的直接杀伤作用不同,复方一枝蒿颗粒主要通过增强脾脏免疫细胞吞噬作用和抑制虫体向脑能远端脏器的侵袭抑制感染鼠的病情发展,推测可能通过调节小鼠免疫功能起到治疗小鼠急性弓形虫感染的作用。