基于弓形虫529-bp重复序列巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank已发表的弓形虫529-bp重复序列(AF146527)设计巢式PCR引物,建立巢式PCR检测方法。结果表明,该方法能扩增出427bp的片段,敏感性试验表明该方法可以检测出0.1pg的弓形虫基因组DNA,敏感性是常规PCR的100倍。巢式PCR方法对蜥蜴利什曼原虫、隐孢子虫、细粒棘球绦虫基因组扩增无条带,特异性强。样品检测符合率达100%。巢式PCR方法的建立为弓形虫病的诊断及流行病学调查提供技术支持。

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529bp重复序列的变异进行研究,从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后,用PCR方法对10个虫株的529bp重复序列进行扩增;扩增产物经纯化后克隆于pGEM-TEasy质粒载体,再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆,然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529bp重复序列都不完全相同,它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529bp重复序列可作为遗传标记,用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定,但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的:构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法:以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果:PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论:成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。

奶山羊弓形虫ITS1和529bp基因序列分析

采集关中某羊场奶山羊的血液样品,以提取的血液基因组DNA为模板对弓形虫ITS1及529bp基因进行PCR扩增、测序,并对测序结果进行比对,基于529bp重复序列构建系统进化树。序列分析结果表明,待测样品与GenBank中弓形虫RH虫株的ITS1序列(AY259044)完全一致,与529bp重复序列(FJ656209.1)存在差异;基于529bp重复序列构建的系统进化树分析结果显示,待测样品弓形虫与RH虫株遗传距离最近。该结果为奶山羊弓形虫病的分子流行病学、诊断方法的建立等方面的研究奠定了基础。

刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

目的 建立高效检测刚地弓形虫（Toxoplama gondii）的环介导等温扩增（LAMP）方法，为弓形虫病诊断提供新的技术手段。 方法 采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物，用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，建立LAMP扩增反应，通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和MgSO4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、猪等孢球虫（Isospora suis）的基因组DNA和超纯水为对照，pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100 copies/ml，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的灵敏性。 结果 设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示，最佳反应总体系为25 μl，其中，甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L，MgSO4最佳浓度为6 mmol/L；添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当，可使反应时间缩短30 min；最佳反应条件为63 ℃ 30 min，80 ℃ 3 min。特异性检测结果显示，所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段， 对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示，LAMP方法的最低检出值达103 copies/ml，效率为PCR扩增（104 copies/ml）的10倍。 结论 建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法，该法具有较好的特异性和灵敏性。

一种弓形虫单管套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊应用

根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收录的相关序列同源,而与山羊泰勒虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫基因组无交叉反应,该方法能够检测出DNA的最小量为1fg。使用该方法对137份奶山羊血液样品进行了检测,发现有38份为阳性。本研究所建立的方法具有特异性强、敏感性高的特点,可用于奶山羊弓形虫病的诊断,有较高的临床应用价值。