miR-544靶向TGF-β抑制神经胶质母细胞瘤细胞迁移、侵袭及EMT

目的探究miR-544在神经胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用及机制。方法采用RT-qPCR检测miR-544及TGF-β在GBM组织和癌旁组织、GBM转移与非转移的病人血清中的表达。在GBM细胞系U251中转染MiR-544 mimics。采用Transwell、Western boltting检测细胞迁移及侵袭,EMT相关蛋白(E-cadherin和N-cadherin)的变化。荧光素酶报告基因验证miR-544与TGF-β基因3’UTR区结合。结果miR-544在GBM组织及转移组中表达显著降低;TGF-β显著升高(P<0.05)。荧光素酶报告证实miR-544靶向调节TGF-β3’-UTR区域。miR-544 mimics组及si-TGF-β组与NC组相比,细胞迁移与侵袭数目减少(P<0.05);E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin蛋白表达减少(P<0.05)。miR-544mimics+pcDNA-TGF-β组部分逆转了miR-544 mimics对细胞迁移与侵袭和EMT相关蛋白的表达的作用(P<0.05)。结论miR-544靶向调控TGF-β是其参与EMT过程的作用机制之一。

miR-544a在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的:探讨结直肠癌患者组织中微小RNA-544a(miR-544a)的表达水平及其与患者预后的关系。方法:选取2016年1月—2019年2月住院并接受手术的150例结直肠癌患者,采用实时荧光定量PCR法检测癌组织中miR-544a的表达情况,免疫组织化学法检测癌组织中Ki67、CD4、CD8表达情况。Mann-Whitney U检验、卡方检验和Fisher精确检验分析癌组织中miR-544a表达水平与患者临床病理指标的关系。单因素和多因素Cox回归分析影响结直肠癌预后的因素。Kaplan-Meier法分析结直肠癌组织中miR-544a表达水平与患者无病生存期(DFS)、总生存期(OS)的关系。结果:结直肠癌组织中miR-544a相对表达水平为1.85±0.15,高于癌旁正常组织的1.06±0.21,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-544a表达水平与周围神经侵犯率、T分期、N分期有关(均为P<0.01),miR-544a高表达组神经侵犯率高,T、N分期较晚。免疫组织化学检测结果显示,miR-544a高表达组Ki67评分为120.2±33.7,低表达组Ki67评分为112.4±40.8,两组差异无统计学意义(P>0.05);miR-544a高表达组患者CD4、CD8评分分别为15.5±5.3和24.8±7.6,均低于miR-544a低表达组(分别为21.3±7.2和29.6±8.9),差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。单因素、多因素Cox回归分析显示肿瘤N、M分期及miR-544a表达水平与CRC患者根治术后DFS、OS显著相关(均为P<0.01)。结论:结直肠癌组织中miR-544a表达水平上调,miR-544a高表达与结直肠癌患者较晚的N、M分期以及不良预后有关,且miR-544a可能是反映免疫治疗效果的潜在标志物。

miR-544a对非小细胞肺癌细胞系Wnt信号通路抑制因子GSK3β表达的调控作用

目的探讨微小RNA-544a(miR-544a)对肺癌干细胞的自我更新能力影响及其可能的机制。方法通过生物信息学预测miR-544a的靶向基因,用荧光素酶报告系统及western blot验证其靶向关系;构建稳定表达miR-544a的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系95C和95D,并用荧光定量PCR验证;用肿瘤球悬浮培养实验检测miR-544a在形成肿瘤球中的作用。结果生物信息学预测发现,miR-544a可以靶向调节Wnt信号通路的抑制子GSK3β,并通过荧光素酶报告系统得到了验证(F=201.37,P<0.01);western blot结果显示,miR-544a可以下调GSK3β的表达,而β-catenin、CD133蛋白表达水平明显上调(F分别为7.73,3.37,9.43,P均<0.01);荧光定量PCR结果显示,95C、95D细胞在转染miR-544a后,miR-544a表达水平增高,分别为20.51±0.97、15.16±1.38(F=418.05,P<0.01)。肿瘤球悬浮培养实验发现,稳定表达miR-544a的细胞能够反复形成具有肿瘤干细胞特性的肿瘤球。结论 miR-544a可以通过直接下调GSK3β的表达来激活Wnt信号通路,以维持肺癌干细胞自我更新能力。

功率放大器OPA544在主动磁悬浮控制系统中的应用

在磁悬浮系统的功放中采用OPA544功率器件实现对系统输出负载电流的放大作用,其性能将随功放的类型而变化。针对毫米级气隙的悬浮系统,设计前级PID控制调理电路,与OPA544功率放大器配合实现差动式电流控制,最终在一台主动磁悬浮平板试验台上实现系统的稳定悬浮,仿真结果与试验情况基本吻合。

转染miR-544a对肺癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的探讨miR-544a对肺癌细胞的侵袭和转移能力的影响及其分子机制。方法用miRNA芯片对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系95C和95D进行miRNA谱系分析,并用荧光定量PCR验证其miR-544a表达水平;用Targetscan软件预测miR-544a的靶基因;Transwell实验观察细胞的侵袭转移能力的变化;western blot验证其表达。结果 miRNA芯片及荧光定量PCR结果显示,与95C细胞(1.00±0.00)比较,miR-544a在95D细胞中表达上调(2.95±0.26,t=12.94,P<0.05);Transwell实验结果显示,95C转染miR-544a mimic后增加(32.00±1.00,q=18.67,P<0.01),95D转染miR-544a inhibitor后,侵袭和转移能力降低(11.00±1.00,q=13.67,P<0.01);Targetscan软件预测E-钙粘连素(CDH1)可能为miR-544a的靶基因;western blot显示,95C转染miR-544a mimic后,CDH1表达下调,vimentin表达上调(0.202±0.017,0.574±0.009,q分别为63.86,9.45,P均<0.01);而95D转染miR-544a inhibitor后,CDH1表达上调,而vimentin表达下调(0.769±0.014,0.320±0.020,q分别为18.67,5.99,P均<0.01)。结论 miR-544a可能通过下调CDH1和上调vimentin的表达来促进肺癌细胞的侵袭和转移。

FAM66E靶向调控微小RNA-544a对非小细胞肺癌细胞迁移侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA FAM66E通过微小RNA-544a(miR-544a)调控非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和侵袭的作用。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测NSCLC细胞(HCC827、NCI-H1975、A549和NCI-H23)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B的FAM66E和miR-544a水平,双荧光素酶报告基因实验鉴定FAM66E和miR-544a间的关系。将NCI-H23细胞分为4组:对照组(未转染)、FAM66E过表达组(转染FAM66E过表达质粒pcDNA3.1-FAM66E+miR-544a NC)、miR-544a过表达组(转染pcDNA3.1空质粒+miR-544a模拟物mimics)和共表达组(转染pcDNA3.1-FAM66E+miR-544a mimics)。MTT实验、划痕实验和Transwell小室实验分别检测转染处理后细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果与BEAS-2B细胞相比,NSCLC细胞的FAM66E水平降低而miR-544a水平升高(P<0.05);miR-544a mimics显著降低了野生型FAM66E的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型FAM66E的不产生显著影响(P>0.05)。与对照组相比,FAM66E过表达组转染处理72 h后NCI-H23细胞活力减弱(P<0.05),miR-544a过表达组则增强(P<0.05),而共表达组的无明显改变(P>0.05)。FAM66E过表达组的穿膜细胞数较对照组的(181.833±9.135)个降低至(69.680±4.313)个,划痕愈合率较对照组的(46.337±3.424)%减少至(26.810±3.558)%,miR-544a过表达组的穿膜细胞数和划痕愈合率较对照组增多至(266.137±15.377)个和(69.392±2.551)%,上述差异均有统计学意义(P<0.05);共表达组的穿膜细胞数和划痕愈合率为(148.047±8.110)个和(48.460±4.143)%,与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论NSCLC细胞中FAM66E水平降低而miR-544a升高,FAM66E可能通过靶向miR-544a来抑制NCI-H23细胞的增殖、迁移和侵袭,在NSCLC中发挥抑瘤作用。

miR-544调控foxo1通路对胶质母细胞瘤增殖、迁移和自噬的影响

目的:探讨miR-544调控foxo1通路调控胶质母细胞瘤增殖、迁移和自噬机制。方法:分别转染miR-544模拟物和抑制物于U251胶质母细胞瘤细胞株,通过MTT增殖试验检测其对U251胶质母细胞瘤细胞增殖影响,划痕实验检测细胞迁移能力,通过RT-PCR检测转染的效果FOXO1mRNA的变化,Westernblotting检测FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的变化。结果:miR-544模拟物转染后及FOXO1mRNA表达上调、FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加,miR-544抑制物转染后FOXO1mRNA表达下调、FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达下调。结论:上调miR-544可通过调控foxo1通路抑制胶质母细胞瘤迁移、侵袭和增加胶质母细胞瘤自噬,有可能作为治疗胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。

布氏菌544A基因片段的PCR扩增及其序列分析

利用ＰＣＲ和ＤＮＡ重组技术，成功的扩增了牛布氏菌（Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ）５４４Ａ基因。回收含Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４ＡＤＮＡ片段，插入ＳｍａＩ单酶切的ｐＵＣ９载体中，进行核苷酸序列分析，证实克隆的ＤＮＡ片段长度为２２４ｂｐ，在该序列中含有单个开放阅读框架。将重组子用Ｋｐｎ１和ＢａｍＨ１双酶切下Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４ＡＤＮＡ片段标记探针，均与６种布氏菌杂交出现阳性结果。说明Ｂｒ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４Ａ２２４ｂｐＤＮＡ片段是６个菌种间的高度保守序列，具有很高的同源性。为布氏病临床医学和流行病学调查研究奠定了基础。

miR-544靶向DUSP13抑制神经胶质瘤细胞增殖、周期分布和凋亡

目的探究miR-544在神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)细胞增殖中的作用及机制。方法采用RT-qPCR检测miR-544及DUSP13在GBM组织和细胞中的表达。过表达miR-544后,CCK-8检测细胞活性变化;克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。DUSP13与miR-544的靶向关系通过荧光素酶报告实验来证实。结果GBM组织和细胞中miR-544表达显著低于癌旁组织和正常细胞(P<0.05),DUSP13表达水平显著高于癌旁组织和正常细胞(P<0.05)。过表达miR-544显著抑制细胞增殖和细胞活力,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡(P<0.05)。过表达miR-544显著降低DUSP1表达水平(P<0.05)。miR-544靶向作用与DUSP13。过表达DUSP13显著削弱过表达miR-544对U87细胞增殖、周期分布和凋亡的影响(P<0.05)。结论miR-544靶向DUSP13抑制神经胶质瘤细胞增殖、周期分布和凋亡,为临床靶向治疗提供新思路。

MicroRNA-544在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的明确微RNA-544(microRNA-544,miR-544)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡、克隆形成及成球能力的影响,探讨其在肝癌发生、发展中的作用。方法利用qPCR法检测二乙基亚硝胺(DEN)造模的大鼠肝组织和人肝癌组织与癌旁组织以及成球培养后肝癌干细胞球中miR-544的表达;肝癌细胞株Hep3B转染miR-544mimic或miR-544inhibitor后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,碘化丙啶(PI)染色后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。肝癌细胞转染miR-544mimic后成球培养观察细胞形成肿瘤干细胞球能力的变化。结果 MiR-544在DEN造模大鼠肝组织及人肝癌组织中的表达分别较未造模大鼠肝组织(P<0.05)和癌旁组织(P<0.01)下调。过表达miR-544可抑制肝癌细胞的增殖(P<0.05,P<0.01)和平板克隆形成能力(P<0.05),并促进细胞凋亡(48h和72h,P<0.01);而在肝癌细胞中抑制miR-544的作用可促进肝癌细胞的增殖(P<0.01)和克隆形成能力(P<0.05)。在富集肝癌干细胞的成球培养中,miR-544的表达下调(P<0.05);而过表达miR-544可抑制肝癌细胞形成干细胞球(P<0.05)。结论 MiR-544在肝癌组织中表达下调,且可抑制肝癌细胞的多种恶性生物学行为,提示其可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌作用。

乙型肝炎病毒X蛋白下调微RNA-544-3p并激活Arf6/Akt-mTOR信号轴促进肝脏细胞迁移和侵袭

目的探讨mi RNA-544-3p对乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)诱导的肝细胞癌的影响及分子机制。方法培养含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx的慢病毒稳转小鼠永生化肝前体细胞株14-19(HBx-EGFP-14-19细胞),并通过向昆明小鼠肝门静脉注射上述细胞构建可长期稳定表达HBx的模型,采用q PCR检测mi RNA-544-3p在HBxEGFP-14-19细胞及小鼠模型肝组织中的表达。在HBx-EGFP-14-19细胞中瞬时转染mi RNA-544-3p模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor),应用划痕愈合实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测mi RNA-544-3p对HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭的影响,采用q PCR和蛋白质印迹法探究mi RNA-544-3p对二磷酸腺苷核糖基化因子6(Arf6)、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)表达的调控作用。结果成功构建了可长期稳定表达HBx的小鼠模型,该小鼠在造模后360 d处死时可见肝组织有恶性肿瘤生成。与对照组相比,HBx-EGFP-14-19细胞和HBx模型小鼠各时间点(造模后30、90、180、360 d)肝组织中mi RNA-544-3p表达水平均降低(P均<0.05)。与对照组比较,转染mi RNA-544-3p mimic的HBx-EGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均降低,转染mi RNA-544-3p inhibitor的HBxEGFP-14-19细胞迁移和侵袭能力均增强(P均<0.05)。q PCR和蛋白质印迹法检测结果显示mi RNA-544-3p低表达与Arf6表达水平上调、Akt-m TOR信号轴的激活有关。结论HBx可能通过下调mi RNA-544-3p激活Arf6/AktmTOR信号轴促进小鼠肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

TDRKH-AS1抑制miR-544a对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响

目的:探讨TDRKH-AS1对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响及分子机制。方法:选取辽阳市中心医院30例肺癌患者的癌组织和相应的癌旁组织,实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织中TDRKH-AS1 mRNA和miR-544a的表达水平;将肺癌细胞A549分为pcDNA组、pcDNA-TDRKH-AS1组、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC组、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;Transwell检测细胞迁移和侵袭;荧光素酶报告实验检测TDRKH-AS1和miR-544a的靶向关系;蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达。结果:与癌旁组织相比,肺癌组织中TDRKH-AS1 mRNA表达水平降低,miR-544a表达水平升高(P<0.05)。与pcDNA组相比,pcDNA-TDRKH-AS1组TDRKHAS1表达水平升高,miR-544a表达水平降低,细胞存活率降低,克隆形成数减少,迁移、侵袭细胞的数量减少,Ki67、N-cadherin的表达水平降低,E-cadherin的表达水平升高(P<0.05)。miR-544a逆转了TDRKH-AS1对A549增殖、迁移、侵袭的影响。TDRKH-AS1靶向调控miR-544a。结论:过表达TDRKH-AS1可能通过下调miR-544a抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

布鲁氏菌野毒株A544和疫苗株104M差异蛋白的表达及抗体制备

选取布鲁氏菌差异蛋白部分基因序列,将其克隆到表达载体p GEX-6p-1中;经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定,得到重组质粒p GEX-6p-1-bru;将重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,用1 mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达,并用表达蛋白制备多克隆抗体。结果:差异蛋白在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子量约为35 k D;诱导5 h后表达量最高,占菌体总蛋白的30%左右;表达蛋白能与多克隆抗体发生免疫印迹反应,证明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为免疫学检测方法的建立奠定了基础。

布鲁氏菌野毒株A544与疫苗株104M的差异蛋白筛选

为给布鲁氏菌病自然感染与疫苗免疫鉴别方法的建立提供参考,采用比较蛋白质组学研究技术,以野毒株A544和疫苗株104M的菌体蛋白为研究对象,以双向电泳技术为分离手段,以基质辅助激光解吸飞行时间质谱为检测手段,利用生物学信息解析所得实验结果。双向电泳结果分析显示,野毒株A544和疫苗株104M之间约有20个差异蛋白点,经质谱成功鉴定了9种蛋白。通过蛋白数据库检索发现,这些蛋白主要参与了一些代谢调节等生物过程,其中有6个蛋白点在野毒株A544上高表达,3个蛋白点在疫苗株104M上高表达。

中美贸易视野下的“国家安全”研究——基于“232调查”和DS544

美国对进口钢铁实施“232调查”拉开了中美贸易摩擦的序幕,随后其又以国家安全为由宣布征收关税。中国对此做出反制并将美国诉至WTO,美国认为基于维护国家安全目的.其行为符合GATT1994第21条(国家安全例外)的规定。文章重点反驳美国观点的不合理之处,指出“美式国家安全”与国家安全例外并不等同,“基本安全利益”可能包括经济福利但有待解释;2018年1月11日发布的《进口钢铁对国家安全影响的报告》对于经济福利与国家安全关系的论证存在明显缺陷,美国欲以国家安全例外为由免除WTO义务于法无据。

Y544挤堵管柱在文南油田的研究应用

在注水开发后期,化学堵水是油田稳油增产的一种必不可少的重要手段。文南油田由于自身地层特性,笼统挤注效果不理想,另外部分井由于井况原因无法笼统挤注,因此必须采用卡封挤堵管柱挤堵。多年来分别应用了Y341、Y221、Y221FX等类型挤堵管柱,但这些管柱都存在或多或少的不足。为了提高了挤堵成功率和封堵效果,降低挤堵施工风险,研究应用了Y544卡封挤堵管柱,通过现场应用,应用效果较好。

机械加工技术专业“544”人才培养模式构建研究

校企交替是工学结合的一种重要形式。基于此,以机械加工技术专业为背景,论述“544”人才培养模式的构建背景,阐述“544”人才培养模式的内涵和定义,阐释“544”人才培养模式的概念和特征,并提出“544”人才培养模式的构建路径。