GGC54GAC MBL突变体的构建

目的 :在人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因中引入GGC5 4GAC点突变。方法 :设计上下游引物和诱变引物 ,以汉族人野生型MBLcDNA为模板 ,采用megaprimer PCR技术进行定点突变 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体 ,酶切和测序分析。结果 :以上游引物和诱变引物进行第一轮PCR ,获得一约 180bp的DNA片段 ,以此片段和下游引物行第二轮PCR扩增 ,得到一长约 780bp的产物 ;将其克隆至pGEM T载体 ,酶切发现第 5 4位密码中的BanI酶切位点已被破坏 ,与计算机酶切图谱分析结果一致 ;序列分析表明 ,除第 5 4位密码变为GAC外 ,余与野生型MBLcDNA完全相同。结论 :构建成功了GGC5 4GACMBL突变体 。

广东地区汉族人MBL基因GGC54GAC点突变的初步筛查

目的 对广东地区汉族人群的甘露聚糖结合凝集素结构基因第一外显子第 5 4位密码点突变 (GGC5 4GAC)进行初步筛查。方法 提取外周血白细胞DNA进行相应片段的PCR扩增 ,再对产物进行单链构象多态性分析。结果 在 16 6人中查出野生型纯合子 14 7例 ,占 88.5 5 % ,GGC5 4GAC突变杂合子 19例 ,占 11.4 5 % ,未发现GGC5 4GAC突变纯合子。结论 广东地区汉族人群MBL基因GGC5 4GAC突变频率为 0 .0 5 7。

汉族人MBL基因ExonI54位密码子点突变及其血浆含量相关性研究

目的 :建立检测MBL基因 5 4位密码子点突变的方法 ,初步调查健康汉族人MBL基因 5 4位密码子点突变的情况 ,检测其血浆MBL含量 ,找出二者的相关性。方法 :根据MBL基因序列设计引物建立MBL基因点突变检测方法即PCR -RFLP ;用MBLOligomerELISA试剂盒测定出血浆MBL的浓度。结果 :建立了特异敏感的检测MBL基因 5 4位密码子点突变的方法 ,测得健康汉族人基因突变频率为 0 .2 32 1 ;健康汉族人血浆MBL含量的平均值为1 999μg/L ,标准差为 1 5 0 5 ;健康汉族人血浆MBL含量与其编码基因Exon 1 5 4位密码子的点突变频率呈负相关 ,χ2 =4 8.1 0 7,P <0 .0 0 1 ;r =- 0 .6 2。结论 :所建立的MBL的PCR -RFLP测定点突变的方法 ,特异性高 ,重复性好 ,较为灵敏 (最低检出量为 1 6 0 pgDNA) ;初步测定了健康汉族人的基因突变频率及其血浆MBL含量 ,二者呈负相关。

MBL突变体在CHO细胞中表达及其产物分析

采用PCR技术,从质粒pMBLm54中获得含GGC54GAC点突变的甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因,将其插入真核表达载体构建重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm54,DNA测序验证序列正确后将其电转染入CHO细胞。以Zeocin筛选并维持培养转染后CHO细胞,获得2株稳定高效表达目的蛋白的单克隆细胞株。采用Ni^(2+)-NTA agarose层析柱纯化表达产物,获得54Asp突变MBL蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析表明,54Asp突变MBL蛋白主要为相对分子质量为60000的成分,而重组野生型MBL蛋白则主要是相对分子质量为200000和>200000的分子。配体结合试验发现,天然MBL和重组野生型MBL能与甘露聚糖结合,而54Asp则否。结果表明,54Asp突变MBL蛋白不能形成正常的MBL结构单位和寡聚体,并进而影响其配体结合活性。

广东地区汉族人MBL基因点突变的研究

目的:研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)。方法:收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变。结果:从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139),GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0)。结论:广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据。