甘薯Iborf56基因的克隆与表达分析

为了研究甘薯叶绿体基因Iborf56的表达是否受到盐胁迫的诱导以及对生长发育的影响,为甘薯的品种选育提供参考,以栗子香为研究材料,从中克隆Iborf56基因,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征,亚细胞定位预测、系统发育分析、调控元件分析、不同组织及盐胁迫表达模式,以及qPCR验证该基因的表达量。结果表明,Iborf56与已知序列相似度为99.28%,开放阅读框长度为929 bp,编码60个氨基酸,含有8个磷酸化位点,没有信号肽和跨膜区,不具有分泌蛋白的特性,主要由α-螺旋组成;亚细胞定位在叶绿体基质中;进化树分析表明,Iborf56与三浅裂野牵牛(Ipomoea trifida)和三裂叶薯(Ipomoea triloba)的遗传距离最近;启动子元件分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、抗逆和激素应答等功能元件。转录组以及实时荧光qRT-PCR定量分析表明,Iborf56在甘薯叶片中的表达量最高且随生长时间增加呈显著上升趋势,推测该基因参与甘薯的生长发育;此外,Iborf56基因的表达量随盐胁迫时间表现为先升后降的趋势,且该基因在盐胁迫下12 h时达到了临界值,暗示其可能参与甘薯盐胁迫响应。

绵羊肺炎支原体膜蛋白p56基因的克隆、表达及反应原性研究

为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。

巨型艾美球虫gam56基因的截短原核表达及其产物的免疫保护效果

为评价gam56基因重组表达产物作为亚单位疫苗预防鸡巨型艾美球虫(E.maxima)感染的效果,以E.maximaNT株配子体总RNA为模板,RT-PCR扩增和克隆gam56基因,选择该基因两段含丰富抗原表位的编码区片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌中进行截短表达。以可溶性的GST-gam56-2融合蛋白为免疫原,设立高、中、低(1.0mg、0.5mg、0.25mg)3个剂量,单独或使用弗氏完全佐剂,于5d、12d和19d对雏鸡进行3次免疫,26d用5×104个E.maxima孢子化卵囊进行攻虫,8d后迫杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析。结果显示:就相对增重率而言各免疫组比未免疫攻毒组的高27.6%以上,而各免疫组之间差异不显著(p>0.05);就卵囊减少率指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度减少,但是均小于75%;就ACI指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度增加,以中剂量蛋白佐剂组为最高。GST-gam56-2融合蛋白对于E.maxima感染具有一定的免疫保护效力。

UL56基因下游3513bp对鸭肠炎病毒生物特性的影响

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158-162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3513 bp(2716-6228位核苷酸)导致UL56基因移框突变。目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少。本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3513 bp插入对DEV生物特性的影响;【方法】以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用Mlu I酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白(RFP)表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP。DEV接种鸭胚成纤维细胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1-2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白(RFP)基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3513bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm^2的细胞瓶中(MOI=0.01),测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5-7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以10^5.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织,固定于4%多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分别以10^3.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),每只10^3.0MLD。观察10 d,每天记录发病死亡情况。【结果】通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值(10^6.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以10^3.0TCID50/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;【结论】成功构建了缺失UL56基因下游3513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3513 bp是DEV的一个毒力决定因子。

HC56基因转染对淋巴瘤或白血病细胞株活力的作用

目的:探讨外源HC56基因产物对B淋巴瘤细胞株Raji和髓系白血病细胞株K562细胞活力的作用。方法:应用脂质体介导的基因转染方法,将外源基因HC56分别导入Raji和K562细胞,用苔盼兰拒染试验,观察外源基因的瞬时表达对细胞活力的作用。结果:Raji和K562细胞转染HC56基因后,与转染PBK/CMV空载体的实验对照组比较,细胞的活力明显受到抑制(P<0.05)。结论:外源HC56基因产物可明显抑制淋巴瘤或白血病细胞株的活力。

实验室保存的恙虫病东方体Karp株与福建省分离株的sta56基因的序列分析

目的比较实验室保存的恙虫病东方体Karp株、福建省两个分离株的sta 56基因序列的差异。方法提取感染各株恙虫病东方体的Vero细胞的DNA,扩增出sta56的ORF。对不同株的ORF进行测序,对15株恙虫病东方体的sta56构建进化树并进行分析。结果实验室保存的Karp株的sta56基因序列有98%与参考株一致;FQ株和NA株仅有两个碱基的差异,有96%的序列与Karp株一致。结论实验室保存的Karp株sta56基因在长期传代中可发生变异,FQ株和NA株均属于Karp株。

转染外源HC56基因对Jurkat细胞足叶乙甙作用敏感性的研究

目的 探讨HC5 6基因与化疗敏感性的关系。方法 把HC5 6基因转染Jurkat细胞 ,经G418筛选 ,获得稳定表达外源HC5 6基因的细胞克隆后 ,应用MTT法 ,观察HC5 6基因产物对Jurkat细胞拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙 (etoposide ,VP16)敏感性的影响。结果 HC5 6基因转染Jurkat细胞 ,在 1μg ml、10 μg ml、5 0 μg ml浓度的VP16作用下 ,对细胞生长的相对抑制率分别为 5 1.7%± 4.2 % ,45 .1%± 3 .7% ,79.6%± 6.2 % ,明显高于在相应的VP16浓度作用下的PBK CMV空载体转染的对照细胞(分别为 9.5 %± 0 .6% ,7.0 %± 0 .5 % ,10 .2 %± 0 .9% ) (P <0 .0 1)。结论 HC 5

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长,并进行序列比较研究。方法小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株,用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因,并采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长,并TA克隆到测序载体pMD18-T vector,测序结果与Karp标准株的同源性为99.4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功,为进一步构建表达载体,进行Sta56蛋白表达研究提供基础。

恙虫病东方体CMY株sta 56基因片段序列分析

目的 了解恙虫病东方体 Ｃ Ｍ Ｙ 株与其它株的关系。方法 测定 Ｃ Ｍ Ｙ 株 ｓｔａ５６ 基因片段的核苷酸序列并与其它株相应序列进行比较。结果 在测定的３２４ｂｐ 序列中， Ｇ Ｃ 含量为４３５ ％ ； 与 Ｋａｒｐ 、 Ｇｉｌｌｉａｍ 、 Ｋａｔｏ 、ｋｕｒｏｋｉ、 Ｋａｗａｓａｋｉ 及 Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉ 株相应序列的同源性分别为９１０ ％ 、８７３ ％ 、８７０ ％ 、８７３ ％ 、８６１ ％ 及７３８ ％ 。结论 Ｃ Ｍ Ｙ 株与已报道的恙虫病东方体菌株不同， 与 Ｋａｒｐ 株有很高的同源性。

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究。ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku。序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点。PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32 a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达。用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究Sp ltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础。

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF56基因的真核表达及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF56基因的结构和序列特征,试验采用锦鲤尾鳍原代细胞增殖培养KHV-CJ,提取DNA,以其为模板经PCR扩增获得ORF56基因,将该基因克隆到PVAX表达载体上,构建重组质粒PVAX-ORF56,并体外表达重组质粒,对KHV-CJ ORF56基因序列与GenBank上已知的对应基因序列进行比对,应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF56基因的结构和功能。结果表明:成功克隆出KHV-CJ ORF56基因;双酶切鉴定显示,目的基因与PVAX表达载体连接;体外表达重组质粒可见绿色荧光;与GenBank上已知序列比对显示,同源性达到99.9%;该基因序列信号肽切割部位最可能位于第26位的组氨酸和谷氨酸之间,没有跨膜区,最大疏水指数为2.174,最小疏水指数为-0.334,其抗原表位主要集中在第1～27,54～143,156～223,254～295位氨基酸。说明KHV-CJ ORF56基因是较好的抗原候选基因。

恙虫病立克次体sta56基因片段的克隆

应用半套式PCR技术从Karp株恙虫病立克次体基因组中扩增出872hpDNA片段。该片段经Pstl消化后，与经PStl酶解的pUC18连接，转化大肠杆菌，电泳初筛得pUCRL3等重组质粒。pUCRL3经PCR及酶切证实含约294hp恙虫病立克次体sta56基因片段，可作为检测恙虫病立克次休的特异核酸探针。

共济失调合并NOP56基因突变一例

遗传性共济失调(hereditary ataxia,HA)是一组以慢性进行性共济失调为主要临床表现的神经变性疾病,病变主要累及脊髓、小脑和脑干[1]。本文报道了1例临床以共济失调为主要症状,影像学证明存在小脑萎缩特征,基因检测发现NOP56基因12号外显子区存在NM_006329:c.1777G>T变异的病例。该突变为无义突变,目前尚未见该位点突变的报道。本文结合文献进行分析,以期为HA的诊断提供更多临床参考。

柞蚕核型多角体病毒odv-e56基因的克隆与分析

为获得柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组序列,采用随机克隆方法,建立ApNPV的质粒基因文库,并通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得了编码包涵体衍生型病毒特异囊膜蛋白基因odv-e56。该基因上游具有晚期调控保守序列TTAAG,是一个晚期表达基因,阅读框为1125bp,共编码374个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性比较结果表明:ApNPV的odv-e56基因与黄杉毒蛾多角体病毒(OpNPV)和云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfNPV)的同源性较高,而与松树小叶蜂核型多角体病毒(NlNPV)和松环螺旋多角体病毒(NsNPV)的同源性最低。由此认为,杆状病毒科的odv-e56基因在进化上存在两种进化方式:一类以点突变为主,基因长度变化不明显;另一类突变以小片段的碱基增减为特征。

新基因C12ORF56在肺癌中的表达特征和功能研究

目的C12ORF56(chromosome 12 open reading frame 56)是一个位于人染色体12长臂14.2区、且目前功能未知的新基因,在多种正常组织及包括肺癌在内的多种肿瘤中均有表达,但是C12ORF56在肺癌中的表达特征及功能尚不明确。在本研究中我们对C12ORF56在肺癌组织及细胞系中的表达及亚细胞定位特征、细胞生理功进行了探讨。方法在ONCOMINE数据库中比较了正常组织和肺癌组织的C12ORF56 mRNA的转录水平;并使用LinkedOmics、Metascape、String和GSEA等工具对C12ORF56及其关联的分子调控网络在肺癌病理过程中的潜在细胞生物学功能进行了预测;通过EdU和CCK-8法评估了特异性siRNA靶向敲降C12ORF56 mRNA对肺癌细胞系NCI-H1073增殖的影响;应用RT-qPCR检测肺癌细胞周期各阶段中C12ORF56的转录水平;采用Jaspar在线工具预测,并通过双荧光素酶报告基因系统明确了影响肺癌细胞系中C12ORF56基因转录的启动子核心区域。结果相对于正常组织,C12ORF56转录本在肺癌组织、特别是在鳞状细胞肺癌中表达明显上调;靶向敲降C12ORF56明显抑制了肺癌细胞NCI-H1703的增殖。结论C12ORF56转录水平在肺癌组织、特别是鳞状细胞肺癌组织中明显上调;上调的C12ORF56通过促进肿瘤细胞的增殖参与肺癌的发生和发展进程。

基因HC56对人肝癌细胞(SMMC7721)基因表达水平的影响

目的 观测新发现的HC56基因对培养的人肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响。方法 用含HC56 cDNA的重组表达载体转染 SMMC-7721细胞后,由细胞总RNA反转录为cDNAs,与Atlas人类cDNA表达方阵膜片杂交,通过molecular image system分析软件对暴光强度进行密度扫描定量(以看家基因β-actin对照校正)。结果HC56转染的肝癌7721细胞有3个基因(C-myc,CAMP dependent proteinkinasetypel beta regulatory subunit β,thymosin β-10)表达上调,3个基因(Glutathione perotidase,fos-related antigen-2,zinc fingerprotein l)表达下调。结论HC56基因转染对体外培养的肝癌细胞的基因表达有不同的影响。本文为进一步研究HC56基因的功能提供了线索。

人类染色体17p13.3位点新克隆基因HC56、HC71和HC90对Jurkat细胞活力的作用

目的 探讨人类染色体 17p13.3位点新克隆基因HC5 6、HC71和HC90对T淋巴瘤细胞株Ju rkat细胞活力的作用。方法 应用脂质体介导的基因转染方法 ,将外源基因HC5 6、HC71和HC90分别导入Jurkat细胞 ,用苔盼兰拒染试验 ,观察基因的瞬时表达对细胞活力的作用。结果 Jurkat细胞瞬时转染HC5 6和HC71基因后 ,与转染PBK/CMV空载体的实验对照组比较 ,第 2 4、4 8、72和 96h ,细胞的活力明显受抑制 (P <0 .0 1) ;Jurkat细胞瞬时转染HC90基因后 ,仅在第 96h细胞的活力受抑制 (P <0 .0 5 ) ,而第 2 4、4 8和 72h ,未发现细胞的活力受抑制 (P >0 .0 5 )。结论 外源HC5

山东地区恙虫病东方体Sta56基因片段扩增与分型研究

目的 鉴定山东地区恙虫病东方体(Ot)基因型别。方法 采用巢式聚合酶链反应技术对23株恙虫病东方体山东株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病患者全血中提取的Ot目的基因进行分析研究,并与Gilliam、Karp、Kato国际参考株进行比较。将群引物扩增产物用双向测序法进行序列测定。结果 35份标本中33份属于Kawasaki型,2份(FXS4 and LHGM2株)属于Karp型。从这33份中选出B-16、FXS2株进行碱基序列测定,结果B-16、FXS2株Sta56基因片段序列与Kawasaki型同源性最高,分别为94.22％、95.21％,而与其他6株Ot同源性均<75.87％.应属于Kawasaki型;FXS4和HGM2株Sta56基因片段序列与Karp型同源性最高,分别为83.03％、96.45％,应属于Karp型。结论 山东地区恙虫病东方体流行株以Kawasaki型为主,但同时存在Karp型。

桑树乳汁蛋白基因MLX56的克隆及生物学功能分析

MLX56是一种分子质量为56 k D,对多种鳞翅目昆虫具有毒性的桑树韧皮部汁液蛋白。利用PCR技术从桑品种湖桑32号的桑树叶片中克隆了MLX56基因,命名为Ma MLX56(Gen Bank登录号:JX432966)。该基因编码区全长为1 203 bp,编码蛋白质含有400个氨基酸,有3个典型的保守结构域,具有信号肽序列,是一种分泌型蛋白质。将克隆得到的Ma MLX56编码区片段插入植物表达载体p BI121,构建植物表达载体p BI121-Ma MLX56,并转化拟南芥获得了转基因植株。转基因拟南芥分别接种甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)和丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tomato DC3000,Pst DC3000)后,植株呈现出较强的抗虫性和抗Pst DC3000侵染能力,推测Ma MLX56在桑树响应生物胁迫过程中具有重要作用。

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。