恙虫病东方体Karp株56-kDa外膜抗原基因片段的原核表达及免疫原性研究

目的探讨恙虫病东方体56-kDa蛋白在大肠埃希菌中的表达及作为诊断性抗原的可行性。方法用PCR扩增恙虫病东方体Karp菌株编码56-kDa蛋白长约1 100bp的DNA,克隆至表达载体pET30a(+)。表达产物经SDS-PAGE、质谱分析及western blot鉴定分析。重组蛋白质纯化后作为包被抗原,用方阵实验确定最佳浓度包被,ELISA法检测其与立克次体目16种成员及10种致病菌阳性血清的反应性。用此重组蛋白质免疫小鼠后制备抗血清,分别用ELISA及间接免疫荧光法(IFA)检测抗血清的效价。结果重组质粒经PCR及测序分析证明,56-kDa外膜抗原的基因片段以正确的读码框连入到pET30a(+)质粒载体中,SDS-PAGE结果表明重组蛋白质在约46-kDa处有表达的目的条带,western blot分析显示该条带可与1∶1 600稀释的兔抗Karp血清反应,证实其具有免疫活性。质谱分析鉴定该蛋白质为恙虫病东方体56-kDa蛋白;方阵滴定确定选择抗原的最佳稀释度为1∶1 600,特异性分析结果表明,重组蛋白质除与查菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体及五日热巴尔通体存在弱交叉反应外,与其他细菌均无交叉反应。IFA及ELISA检测表明抗血清效价可达1∶1 600。结论构建的重组蛋白质可以作为恙虫病东方体快速诊断的抗原。

合肥首例恙虫病病人血中东方体56kDa外膜蛋白部分基因的扩增及进化分析

采用恙虫病胶体金快速诊断试剂对安徽省合肥市一例不明原因发热病人血清进行检测，从该病人血块中提取DNA为模板，用恙虫病东方体特异性引物，PCR扩增出56kDa外膜蛋白部分基因，将扩增目的片段克隆至T载体进行测序并进行基因进化分析。结果显示，该病人血清中抗恙虫病东方体总抗体、抗东方体IgG及抗东方体IgM阳性；患者给予强力霉素治疗后迅速退热。采用PCR从病人血标本中扩增出1320bp东方体56kDa外膜蛋白基因片段，将基因片段测序结果在NCBI上做BLAST比对，显示该基因序列与昆明株和内蒙古株同源基因序列完全一致；进化树分析显示该序列与标准株Kuroki位于同一个分支。研究确认该发热病例为合肥市报告的首例恙虫病，其感染的恙虫病东方体为Kuroki型，推测合肥市可能为恙虫病新疫区。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法 采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论 Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。

恙虫病立克次体Giliam株56-kDa蛋白基因的克隆及其5'-和3'-端序列分析

目的克隆恙虫病立克次体Ｇｉｌｉａｍ株５６－ｋＤａ蛋白基因，作为优化ＰＣＲ反应时的标准模板和为Ｇｉｌｉａｍ株５６－ｋＤａ蛋白基因的表达作准备。方法利用ＰＣＲ反应和Ｔ载体分别扩增和克隆目的基因片段，并用序列分析方法鉴定克隆基因的正确性。结果克隆的基因为恙虫病立克次体Ｇｉｌｉａｍ株５６－ｋＤａ蛋白基因。结论利用ＰＣＲ反应和Ｔ载体可以从少量的标本中，高效获得高纯度的目的基因。