海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用

为了探讨切割海马伞后的海马和正常海马在蛋白表达方面的差异,获取海马中具有生物活性的特异蛋白,并观察其对人胚神经干细胞迁移的影响,取切割SD大鼠海马伞后10、14、20d及正常海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d海马和正常海马的56kD差异蛋白胶条及空白对照胶条共培养,观察神经干细胞球中神经干细胞迁移情况,第3d时计数朝胶条方向1/4扇区内的迁出细胞数。结果显示,切割后各天组和正常组比较见多条差异蛋白条带,其中56kD差异蛋白的密度积分正常组最低,10d组和20d组较高,14d组最高。神经干细胞球中向56kD差异蛋白胶条方向迁移的细胞数在切割组最多,正常组次之,对照组最少。提示切割海马伞后的海马与正常海马间存在多种差异蛋白,其中56kD蛋白在切割海马伞后14d表达量最高,并具有诱导神经干细胞迁移的作用。

恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。

PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建

为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料 ,采用二次连接法将存在于克隆载体 p L R5 6中的马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒p ROK 中 ,采用三亲融合法和直接导入法转化根癌农杆菌 LBA4 40 4 ,PCR法检测。实验表明 ,二次连接法效果优于一次连接法 ,两种连接法对比 ,二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便 ,二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码植物转化载体 ,建立了高效。

柞蚕雌蛾粘液腺内容物中56kD蛋白的初步分离与纯化

[目的]为下一步阐明柞蚕粘液腺内容物中56 kD蛋白的功能提供参考。[方法]利用SDS-PAGE,分离柞蚕粘液腺内容物中56kD蛋白,并对其进行初步纯化。采用蛋白印迹法,将其成功转移至PVDF膜,检测其转移效果。[结果]通过对56 kD蛋白的分离和初步纯化,得到单一的蛋白质谱带。经电泳转移后的凝胶和PVDF膜染色结果表明,凝胶中未见蛋白谱带出现,而PVDF膜上的目的蛋白谱带清晰可见,表明56 kD蛋白质已经完全转移至膜上。[结论]该研究为目的蛋白的进一步纯化和氨基酸序列分析奠定了基础。

大鼠海马中56KD、83KD蛋白诱导神经干细胞向神经元分化的协同作用研究

目的:探讨切割海马伞大鼠海马中56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面是否具有协同作用。方法:切割海马伞后的海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,取低分子量区的56KD、65KD和83KD 3条差异蛋白条带电洗脱后以不同的组合加入鼠胚神经干细胞的分化培养液中诱导神经干细胞分化,12天后行MAP-2免疫荧光染色,记数其中MAP-2阳性神经元数,胞体面积和细胞周长。用STATA7.0软件进行方差分析和两两比较。结果:56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组MAP-2神经元的数量是47.1±9.64,43.7±8.41,胞体大,突起丰富;65KD+83KD组、56KD+65KD组、56KD组和83KD组MAP-2神经元的胞体较小,突起较短;65KD组和对照组的神经元胞体最小,突起最短。MAP-2神经元的数量、面积和周长统计分析结果显示:56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组与其他6组均有显著性差异。56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组之间没有显著性差异;65KD+83KD组、56KD+65KD组、56KD组和83KD组四组之间没有显著性差异,但是它们与65KD组和对照组均有显著性差异,65KD组和对照组之间没有显著性差异。结论:56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面具有协同作用。

马铃薯卷叶病毒56kD蛋白基因及3'端非编码区克隆和序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列，设计合成一对特异性引物。以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成了ｃＤＮＡ第一条链，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中。进一步用ＰＣＲ鉴定，限制酶切分析和序列分析。结果表明，ＰＬＲＶ－Ｃｈ５６ｋＤ蛋白基因由１５２７个核苷酸组成，编码５０８个氨基酸，３＇端非编码区由１４１个核苷酸组成，与国外报道的苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ、荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ、加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ、澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ各株系核苷酸序列和氨基酸序列有很高的同源性。５６ｋＤ蛋白基因核苷酸同源率分别为９７．１％、９７．８％、９７．１％和９３．９％，推测的氨基酸同源率分别为９６．２％、９６．４％、９５．８％和９４．６％，非编码区核苷酸同源率分别为９７．９％、９７．２％、９８．６％和９８．６％。

恙虫病东方体Kato株56kD蛋白基因的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi) 5 6kD保护性抗原蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。 方法 采用PCR方法 ,从O .tsutsugamushiKato株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kD基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE 5 6 ,IPTG诱导表达 ,SDS PAGE检测有无蛋白的表达。结果 (1)获得长约 15 0 0bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知Kato株 5 6kD基因序列相同 ;(2 )SDS PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 5 6× 10 4处有表达带 ;(3)表达后菌体超声破碎后 ,目的蛋白主要以包涵体形式存在。结论 获得了 5 6kD基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达。

戊型肝炎病毒Ⅳ型ORF2蛋白在汉逊酵母中的表达

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据汉逊酵母偏爱密码子优化设计目的基因,用搭桥PCR法合成优化后的基因序列,并克隆到多拷贝表达载体上,转化汉逊酵母营养缺陷宿主菌ATCC26012(Ura3-),在选择培养基上培养,运用PCR法筛选得到携带外源基因的重组菌株,然后用含甲醇的培养基诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测和鉴定。SDS-PAGE实验结果表明目的蛋白分子量约为56kD,表达量占菌体总蛋白的12%;ELISA检测结果表明表达产物为具有免疫反应性的HEVORF2蛋白,ELISA效价最高可达1∶2048,目的蛋白表达量随着基因拷贝数的增加呈升高的趋势;Westernblot鉴别实验结果证实表达产物与HEV多抗有特异性抗原抗体结合反应。HEV结构区ORF2蛋白在汉逊酵母中的成功表达,为研制基因工程戊型肝炎疫苗奠定了基础。

恙虫病东方体平潭岛株重组抗原的制备及快速诊断试剂的研制

目的制备重组抗原,利用胶体金技术研制恙虫病快速诊断试剂。方法用PCR扩增出Ptan株编码56kD外膜蛋白长约1352bp的DNA,克隆至原核载体pET28a,构建了表达载体。表达产物经SDS-PAGE及Western-blot进行鉴定分析。将Ptan株和Gilliam56kD截短重组抗原混合作为诊断抗原,研制胶体金免疫层析诊断试纸检测血样中的恙虫病特异性总抗体、IgM和IgG。结果SDS-PAGE表明重组蛋白在相对分子质量约52kD处有表达目的条带,Western-blot证实该蛋白具有免疫活性。胶体金免疫层析法检测抗恙虫病东方体总抗体、IgM、IgG和IFA法检测IgG的敏感性分别为94.5%,81.4%,91.6%和86.2%,胶体金免疫层析法检测总抗体、IgM、IgG特异性分别为98.1%,100%,98.9%。结论胶体金层析法可替代常规IFA法用于恙虫病诊断。

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的 构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。 方法 从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。 结果 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子?

黑龙江省庆安县小兽体表恙螨及恙虫病东方体感染调查

目的调查黑龙江省绥化市庆安县山地和平原地区小兽体表寄生恙螨和恙虫病东方体的感染情况。方法于2013年9月利用夹夜法捕获小兽,鉴定种类并梳检小兽体表恙螨,对恙螨种类进行鉴定并计算恙螨指数;无菌解剖小兽肝、脾等脏器,低温保存,提取其DNA,采用巢氏PCR扩增恙虫病东方体56 kD表面蛋白基因。结果共捕获小兽107只,包括啮齿目和食虫目共9种;农村居民区室外以黑线姬鼠为主,室内仅捕获褐家鼠和小家鼠;农田以黑线姬鼠为主,林区以黑线姬鼠和朝鲜姬鼠为主;小兽体表共检获1 164只恙螨,包括高丽新恙螨、东方纤恙螨、日本新恙螨和亚中纤恙螨;林区的棕背鼠平恙螨指数最高,为65.50,大仓鼠、红背鼠平和花鼠次之,分别为58.13、22.86和24.00;距林区较远的农田和居民区小兽体表未发现恙螨。山区大仓鼠和朝鲜姬鼠各1只经PCR恙虫病东方体核酸检测为阳性。结论庆安县小兽及其体表恙螨种类与东北北部其他地区类似,鼠类中检出恙虫病东方体,该地区是新发现的恙虫病自然疫源地,应开展人群流行病学调查。

海南省680例不明原因发热患者恙虫病东方体感染调查

目的了解海南省不明原因发热患者的恙虫病东方体检感染情况,为不明原因发热患者恙虫病防治提供指导。方法收集2018—2021年海南医学院第一附属医院、海南医学院第二附属医院、海口市人民医院和琼中黎族苗族自治县人民医院临床诊断为不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和PCR方法分别对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时收集样本的临床及流行病学信息,并进行流行病学分析。结果共收集临床不明原因发热患者血样680份,恙虫病东方体IgM、IgG抗体和56kD型特异性抗原PCR阳性率分别为23.97%(163/680)、36.62%(249/680)和20.88%(142/680),焦痂或皮疹率为12.06%(82/680)。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为223例,其中男性111例(49.78%),女性109例(48.88%),平均年龄(53.14±15.12)岁,其中40~<60岁98例(占43.95%),感染人群民族中汉族136例(占60.99%),农民93例(41.70%),秋季发病114例(51.12%)。临床表现以非特异性症状与体征为主,36.77%患者出现皮肤特异性溃疡或焦痂。结论海南省是恙虫病的疫源地,流行时间有明显的季节性,预防重点应是秋季的农村地区,临床特征以高热和焦痂或溃疡为主。