HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答

构建编码HBV包膜 核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗 pHBs、pHBc ,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度 ,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗 ,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答 ,表明HBV包膜 核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效 .

PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建

为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料 ,采用二次连接法将存在于克隆载体 p L R5 6中的马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒p ROK 中 ,采用三亲融合法和直接导入法转化根癌农杆菌 LBA4 40 4 ,PCR法检测。实验表明 ,二次连接法效果优于一次连接法 ,两种连接法对比 ,二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便 ,二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码植物转化载体 ,建立了高效。

鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白(Etmic-2)与鸡泛素融合蛋白基因的DNA疫苗表达载体的构建

本文用RT_PCR技术从鸡的肌肉组织中扩增出泛素 (ubiquitin_Ub)编码基因 ,再将其定向克隆到真核表达载体pCMV_Script中多克隆位点的BamHⅠ、HindⅢ之间 ,构建成重组质粒pCMV_Ub。经酶切和测序确定为正确后 ,再将来源于E .teella裂殖子的Etmic_2基因克隆到pCMV_Ub质粒中Ub基因下游的SalⅠ位点上 ,经酶切鉴定 ,获得编码Etimc_2基因的真核表达载体pCMV_Ub_mic_2。该载体中的Etmic_2基因与Ub融合表达 ,并将用于DNA疫苗免疫鸡 ,希望融合了Ub的Etmic_2蛋白能更有效的进入MHC_Ⅰ循环 。

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的

IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价

目的评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果。方法HBVTg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S+pFP、pS2.S+pcDNA3.1免疫治疗和pcDNA3.1对照组,联合免疫质粒总剂量40μg/只,按1∶1比例混合接种。初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答。结果HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周(13317±2539)拷贝/ml、第12周(6462±3359)拷贝/ml时分别较免疫前(36159±7769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S+pcDNA3.1组第4周(20618±9523)拷贝/ml及第8周(23818±5319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36090±4421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27691±13071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S+pFP组Tg小鼠个体血清HBVDNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。结论Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBVDNA疫苗抑制Tg鼠HBVDNA复制和表达的治疗作用。

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。

日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达

[目的]构建日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因(ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Schistosoma japonicum,SjAslp)核酸疫苗,并观察其在真核细胞中的表达情况。[方法]根据GenBank中SjAslp cDNA全长设计特异性引物,从实验室已构建好的重组质粒pBCSK+/SjAslp中扩增出SjAslp cDNA全长,将其克隆入pUCm-T.载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建成日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶全基因核酸疫苗(pcDNA3.1(+)/SjAslp);经PCR、酶切及测序鉴定后,利用电穿孔将其转染HeLa细胞。采用免疫细胞化学法检测SjAslp在HeLa细胞内的表达情况。[结果]成功构建SjAslp核酸疫苗,免疫细胞化学技术检测其能在HeLa细胞浆内表达。[结论]pcDNA3.1(+)/SjAslp核酸疫苗能在真核细胞内表达,为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打下了必要的基础。

马铃薯卷叶病毒56kD蛋白基因及3'端非编码区克隆和序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列，设计合成一对特异性引物。以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成了ｃＤＮＡ第一条链，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中。进一步用ＰＣＲ鉴定，限制酶切分析和序列分析。结果表明，ＰＬＲＶ－Ｃｈ５６ｋＤ蛋白基因由１５２７个核苷酸组成，编码５０８个氨基酸，３＇端非编码区由１４１个核苷酸组成，与国外报道的苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ、荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ、加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ、澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ各株系核苷酸序列和氨基酸序列有很高的同源性。５６ｋＤ蛋白基因核苷酸同源率分别为９７．１％、９７．８％、９７．１％和９３．９％，推测的氨基酸同源率分别为９６．２％、９６．４％、９５．８％和９４．６％，非编码区核苷酸同源率分别为９７．９％、９７．２％、９８．６％和９８．６％。

牡丹籽蛋白酶解产物对禽多杀性巴氏杆菌ptfA基因DNA疫苗免疫效果的影响

为研究牡丹籽蛋白酶解产物对禽多杀性巴氏杆菌(Pm) ptfA基因DNA疫苗免疫效果的影响,本研究以牡丹籽蛋白酶解产物为佐剂制备佐剂-DNA疫苗,分别以DNA疫苗和佐剂-DNA疫苗免疫鸡,同时设置牡丹籽蛋白酶解产物灌胃-DNA疫苗免疫组以及弱毒疫苗、pcDNA3.1(+)空载体和PBS对照组。每两周免疫一次,共免疫3次。间接ELISA检测免疫后鸡血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫鸡外周血淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测鸡IL-2和IL-4的分泌情况。三免2周后以强毒菌株CVCC474 (5 LD50/只)攻毒,计算强毒攻击后各组鸡的存活数及保护率。结果显示,佐剂-DNA疫苗组和灌胃组鸡的血清特异性抗体水平与DNA疫苗组相比无显著差异(p>0.05)。三免后,佐剂-DNA疫苗组和灌胃组鸡的SI值和IL-4水平显著高于DNA疫苗组(p<0.05)。二免和三免后,佐剂-DNA疫苗组和灌胃组鸡的IL-2水平明显高于DNA疫苗组(p<0.05),且为免疫鸡提供的保护率高于DNA疫苗,其中以牡丹籽蛋白酶解产物为佐剂时效果较好,但均不及弱毒疫苗。表明预先灌胃牡丹籽蛋白酶解产物或以其为佐剂均可在一定程度上增强ptfA基因DNA疫苗的免疫效果。本研究为Pm DNA疫苗的研究及牡丹籽蛋白酶解产物在疫苗佐剂中的应用提供一定的参考。

PEI磁珠吸附IBRV主要囊膜蛋白基因的DNA疫苗的构建

通过利用实验已经构建好的表达IBRVgB/gC/gD囊膜蛋白的真核表达质粒(pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His)为免疫原,以PEI磁珠为载体,PEG为保护层构建DNA疫苗。将构建好的真核表达质粒,通过鉴定、扩增、大提后,使PEI磁珠与其吸附并转染至小鼠胚胎细胞(NIH/3T3)鉴定蛋白表达情况,此后进行疫苗制备并通过电镜观察其形态特征。结果表明:三种蛋白均能在小鼠细胞中表达,所制备DNA疫苗在电子显微镜下可观察到PEG包裹在最外层,粒径均在100 nm以内。成功构建了以PEI磁珠吸附IBRV gB gC gD基因并包裹PEG保护层的DNA疫苗,验证其在小鼠表达系统中可以成功表达,为后续对小鼠免疫效果的评价奠定了基础。

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因是新近被确定的非哺乳类IL 2基因。将鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2 VP4 VP3 )分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P <0 0 5 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应 (P <0 0 5 )。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。

牛疱疹病毒Ⅰ型VP22和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合基因DNA疫苗的免疫效应

为了提高表达GP5的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗的免疫效应,将具有蛋白转导功能的牛疱疹病毒1型(BHV1)VP22基因插入到经过修饰具有更好免疫原性的PRRSV修饰型ORF5基因(ORF5M)上游,构建VP22和ORF5M融合表达的真核表达质粒pCIVP22ORF5M。经间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblot检测证实体外表达后,免疫BALBc小鼠,检测小鼠免疫后的GP5特异性ELISA抗体、抗PRRSV中和抗体和脾淋巴细胞增殖反应,并与非融合的真核表达质粒pCIORF5M进行比较。结果显示,融合表达VP22GP5的DNA疫苗pCIVP22ORF5M诱导的体液免疫和细胞免疫反应均明显高于非融合表达的DNA疫苗pCIORF5M,表明蛋白转导相关蛋白BHV1VP22能显著增强表达GP5的PRRSVDNA疫苗的免疫效应,有效发挥了基因免疫佐剂效应;这为研制PRRSV高效DNA疫苗奠定了基础,同时也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，检测ＤＮＡ疫苗编码的ＨＣＶ核心蛋白的表达。结果：３０％（３／１０）免疫小鼠产生ＨＣＶ核心蛋白抗体，该抗体能检测到重组质粒在ＮＩＨ３Ｔ３细胞表达的ＨＣＶ核心蛋白。

猪瘟病毒囊膜糖蛋白DNA疫苗的研制

构建了含有猪瘟病毒石门株囊膜糖蛋白（Ｅ２）基因的重组真核表达质粒ｐＲＣＳＥ２。将ｐＲＣＳＥ２和空载体ｐＲＣ分别免疫小鼠，ＥＬＩＳＡ检测结果表明：仅ｐＲＣＳＥ２免疫鼠可以产生猪瘟病毒的特异抗体。ＤＮＡ疫苗在许多传染病研究中已取得可喜成果，因此猪瘟病毒ＤＮＡ疫苗可能会成为防制猪瘟的一条新的途径。

靶向融合防龋DNA疫苗研究(Ⅱ)—编码人Ig基因的质粒pJIg的构建

目的 :构建编码人免疫球蛋白Igγ1铰链区和恒定区基因的质粒pJIg ,为进一步研制靶向融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :从人外周淋巴细胞中获得细胞总RNA并合成cDNA第一链 ,利用半巢式PCR扩增Igγ1恒定区序列 ,进行T -A克隆 ,构建 pJIg质粒 ,酶切电泳 ,并测序鉴定。 结果 :RT -PCR获得了目的基因 ,质粒 pJIg携带有Igγ1目的片段基因。 结论 :成功构建编码人免疫球蛋白Igγ1恒定区基因的质粒 pJIg。

不同培养条件对基因工程疫苗菌抗原蛋白表达的影响

基因工程菌的表达条件研究在现代生物高技术产业化的发展中具有重要的意义 .影响基因工程菌表达的因素主要有 pH值、温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等 .笔者分别就以上因素对基因工程菌抗原蛋白表达的影响进行了初步研究 .在摇床培养条件下 ,外源基因表达蛋白的最适表达条件为终浓度 0 .8mmol/L的IPTG ,32℃ ,诱导 6h .

日本血吸虫SjC23 DNA疫苗基因枪免疫小鼠诱导免疫保护作用的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株 2 3k Da膜蛋白 DNA疫苗基因枪免疫诱导 BAL B/ c小鼠产生的抗血吸虫感染作用。方法 6 0只雌性 BAL B/ c小鼠随机分为 6组 :pc DNA3.1组 (对照组 ) ,每只小鼠用基因枪经腹部皮肤免疫 pc DNA3.1质粒 DNA2次 ,共 2 μg;Sj C2 3基因枪 (gg)组 ,每鼠用基因枪免疫 pc DNA3.1- Sj C2 3质粒 DNA2 μg;Sj C2 3肌注 (im)组 ,每鼠肌注 10 0 μg pc DNA3.1- Sj C2 3质粒 DNA;Sj C2 3/ Cp G(gg)组 ,每鼠用基因枪免疫 pc DNA3.1- Sj C2 3/ Cp G质粒 DNA2 μg;Sj C2 3/Cp G(im)组 ,每鼠肌注 10 0 μg pc DNA3.1- Sj C2 3/ Cp G质粒 DNA;联合免疫组 ,每只小鼠先肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj C2 3/ Cp G质粒 DNA,第 2天用基因枪免疫 2 μg。各组小鼠隔 2周加强免疫 1次 ,共 3次。末次免疫后 4周每鼠经腹部皮肤攻击感染 (45± 1)条日本血吸虫尾蚴 ,4 5 d后剖杀 ,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前 2天及感染前 2天经尾静脉采血检测 Ig G抗体水平及抗体亚类 Ig G1 、Ig G2 a。末次免疫后 3周检测脾细胞经 Con A和 r Sj C2 3- HD刺激后培养上清中鼠 IL- 2、IL- 4和 IFN- γ的水平。结果 Sj C2 3(gg)组、Sj C2 3/ Cp G(gg)组及联合免疫组小鼠所检成虫数均低于对照组 (P均 <0 .0 1) 。

MIP-1α和Flt3l基因佐剂联合应用对HPV16E7 DNA疫苗的免疫增强作用

目的:探讨巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和酪氨酸激酶受体3配体(Flt3ligand,Flt3l)基因佐剂联合应用增强人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus16,HPV16)E7DNA疫苗免疫效果的可能性。方法:构建真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7。C57BL/6小鼠随机分为8组,分别为pcDNA3组、pcDNA3/MIP-1α组、pcDNA3/Flt3l组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/Flt3l混合组、pcDNA3/HPV16E7组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组以及pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组。每组14只,肌肉注射质粒免疫小鼠,每3周免疫1次,共3次;末次免疫后2周每组随机抽取6只小鼠,取脾脏制备淋巴细胞悬液,用CCK-8试剂盒检测其对TC-1靶细胞的特异性杀伤能力。其余小鼠在腹股沟处皮下注射5×104个TC-1细胞,观察肿瘤生长情况。结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7;pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的CTL杀伤能力明显高于其它各组(P<0.01);肿瘤细胞攻击后16天,pcDNA3组小鼠全部长出肿瘤,而pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的成瘤率仅为12.5%,明显低于其他组,统计学分析示8组之间成瘤率差异有显著性(P=0.007)。60天后各组成瘤率之间的差异无统计学意义(P=0.229)。结论:联合应用MIP-1α和Flt3l基因佐剂增强了HPV16E7DNA疫苗的免疫效果,一定程度上延缓了肿瘤的发生。

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定

目的 为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法 用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果 构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论 本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。