恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法 根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果 SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论 表达产物初步鉴定具有生物活性 。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法 采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论 Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因进行原核表达 ,并对表达产物进行纯化 ,以获得有生物活性的重组蛋白 ,用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码 5 6kDa抗原长约 132 0bp的DNA ,克隆至原核载体PET2 8a ,构建了表达载体PET -OTG ,并获表达。表达产物经镍 (Ni2 +)柱亲和层析纯化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)及蛋白印迹 (Western -blot)分析鉴定 ,并用间接ELISA进行抗原性分析。结果 SDS -PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达 ,在相对分子质量约 5 2kDa处有表达目的条带。经Ni2 + 层析柱纯化得到目的蛋白 ,包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白 ,达电泳纯。Western -blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别 ,用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性 ,能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性 ,有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。