NS5ATP9与HBx相互作用促进HBV cccDNA的形成与转录

目的探讨丙型肝炎病毒NS5A反式调节蛋白9(hepatitis C virus NS5Atransactivated protein 9,NS5ATP9)在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)形成与转录中的作用机制。方法利用1.3拷贝HBV表达质粒转染Huh7和HepG2细胞、整合有4拷贝HBV基因组的HepG2.2.15细胞、在诱导型四环素启动子控制下表达HBV的HepAD38细胞构建NS5ATP9过表达或干扰的HBV细胞模型,收集样品和细胞上清液,提取RNA、HBV核心DNA(coreDNA)、cccDNA和蛋白,利用酶联免疫吸附试验、实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、Southern blot和Western blot技术检测HBV总RNA、前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)、乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus s antigene,HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigene,HBeAg)、松弛环状DNA(relax circular DNA,rcDNA)以及cccDNA水平。在HepG2细胞中转染乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx),通过免疫荧光成像及免疫共沉淀方法检测NS5ATP9与HBx的结合情况。双荧光素酶报告基因实验检测NS5ATP9对HBx启动子活性的影响。利用Huh7细胞转染HBV1.3及HBV稳定表达细胞株HepG2.2.15和HepAD38转染NS5ATP9过表达/干扰质粒,通过Western blot技术检测DDB1和SMC6的蛋白水平。结果在HBV病毒活跃的细胞中,NS5ATP9 mRNA水平[HepG2.2.15细胞:1.891±0.567比1.00±0.034,t=2.87,P=0.0351;HepAD38 tet+细胞:1.978±0.399比1.00±0.034,t=4.131,P=0.0091;HepAD38 tet-细胞:2.642±0.672比1.00±0.034,t=4.127,P=0.0091]和蛋白水平均显著增加。过表达NS5ATP9后可显著增加HBeAg[(5.402±0.327)S/COV比(2.68±0.552)S/COV,t=7.35,P=0.0018]、HBsAg[(2.846±0.185)S/COV比(1.512±0.221)S/COV,t=8.02,P=0.0013]、HBV pgRNA及rcDNA的表达水平,而干扰NS5ATP9后此增加作用消失[HBeAg:(2.029±0.09)S/COV比(3.733±0.445)S/COV,t=6.501,P=0.0029;HBsAg:(1.501±0.105)S/COV比(1.878±0.174)S/COV,t=3.216,P=0.0324)]。机制研究显示,NS5ATP9和HBx蛋白主要位于细胞核核仁内,并具有共定位信号,且NS5ATP9可显著提高HBx启动子(1071.06±79.44比488.47±40.12,t=13.09,P=0.00012)的转录活性。另外,过表达NS5ATP9可显著降低DDB1和SMC6的蛋白水平,而沉默NS5ATP9则可显著提高DDB1和SMC6的蛋白水平。结论HBV上调NS5ATP9的表达,形成HBV-NS5ATP9-HBV cccDNA-HBV的正反馈环路,NS5ATP9通过与HBx相互作用上调肝细胞中HBV cccDNA的形成与转录,进而促进慢性乙型肝炎的发生发展。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X- α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin (MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15; 1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因. 结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵 (microarray)技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因 ,阐明慢性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌 (HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A。以pcD NA3 1(-) NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 1(-) NS5A转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因 ,命名为NS5ATP13 ,在GenBank中登录 ,登录号为D2 12 62。NS5ATP13基因的编码序列全长为 2 10 3个核苷酸 (nt) ,编码产物由 70 0个氨基酸残基 (aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反?

小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析

目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列, 确定编码产物序列,并对于其与人的NSSATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析. 方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析. 结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸(nt)组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基(aa)组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%. 结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及编码产物的序列.

丙型肝炎病毒非结构蛋白HS5A反式激活基因HS5ATP6的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的KOZ2ak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。结果 从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应(RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP6,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 67。NS5ATP6基因的编码序列全长为 15 72个核苷酸 (nt) ,编码产物由 5 2 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP6的筛选与克隆 。

Ni-5at.%W合金基带阳极极化行为的研究

研究了Ni-5at.%W合金基带在磷酸-硫酸及有机添加剂体系中的阳极极化行为。结合扫描电镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)分析,对不同阳极极化电位区间基带表面微观形貌和相组成进行了讨论。在低电位区,电极上主要析出的是Ni(OH)2、Ni3(PO4)2及NiSO4晶体层;在高电位区,电极表面主要形成的是Ni2O3高价氧化物膜。

白细胞中与NS5ATP5蛋白结合的蛋白基因的筛选与克隆

目的:采用酵母双杂交体系寻找与NS5ATP5相互作用的白细胞蛋白,以探讨NS5ATP5的生物功能. 方法:应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP5诱饵质粒, 转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析. 结果:筛选出10个与NS5ATP5特异性相互作用的克隆,其中1个为金属硫蛋白,1个为热休克蛋白HSP60,1个为主要组织相容性复合体Ⅱ淋巴细胞抗原DQB,5个为人类重排免疫球蛋白λ-轻链,2个是未知功能基因. 结论:初步克隆了NS5ATP5与白细胞结合蛋白基因,对NS5ATP5的功能研究有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP5相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础.

应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因. 方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。

基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术.检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响.进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:没计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDN.A3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.

新基因NS5ATP4表达产物下调细胞周期素B2基因表达的研究

目的探讨新基因NS5ATP4表达产物对细胞周期素B2(cyclinB2)基因启动子转录的调节作用。方法根据文献确定细胞周期素B2的启动子区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素基因因启动子(B2p),克隆至真核报告基因表达载体pCAT3Basic中,构建pCAT3cyclinB2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性并与pcDNA3.1()NS5ATP4共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得细胞周期素B2启动子的正确克隆。pCAT3cyclinB2p和pcDNA3.1()NS5ATP4共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3Basic空载体的10倍,pCAT3cyclinB2p的0.14倍。结论本文克隆的细胞周期素B2启动子有顺式调节下游基因表达的活性,NS5ATP4对细胞周期素B2基因的转录具有下调作用。

应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NSSATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP9后,有16条差异基因表达水平发生显著改变,其中3条基因表达增强,13条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因,为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据.

应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因

目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有C-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1 个,RNA多聚酶Ⅲ3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1 个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个. 结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.

NS5ATP9对饥饿诱导的肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用

目的观察NS5ATP9对饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用随时间的变化。方法将NS5ATP9的表达载体、siRNA小分子干扰及其各自的对照分别转染HepG2细胞48小时后,分别用EBSS饥饿细胞12小时、24小时、36小时和48小时后,利用Annexin V/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。同时利用化学发光法检测胱冬肽酶-3/7(caspase-3/7)的活性变化,观察饥饿不同时间点NS5ATP9对细胞凋亡的作用变化。结果①与对照组相比,NS5ATP9过表达组在HepG2饥饿24小时、36小时和48小时后,总凋亡率显著减低(t=17.132、9.138、17.318,P=0.003、0.012、0.003);12小时、36小时和48小时caspase-3/7酶活性显著减低(t=7.637、6.944、13.490,P=0.017、0.02、0.005),二者均以48小时最显著。②与对照组相比,si-NS5APT9转染组在HepG2饥饿36小时和48小时总凋亡率显著增加(t=-5.064、-4.342,P=0.034、0.049),12小时、36小时和48小时caspase-3/7酶活性显著增加(t=-8.837、-7.469、-18.630,P=0.013、0.017、0.003),二者均以48小时最显著。结论在HepG2细胞中NS5ATP9能显著抑制饥饿诱导的细胞凋亡,随着饥饿时间的延长,NS5ATP9对细胞凋亡率的抑制越明显,以48小时最为显著。

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCVNS5ATP13表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATPl3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并合成cDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCVNS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 10 2个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 96个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 40个插入片段测序分析 ,其中 2个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录 ,另有 3 4个为已知功能序列。结论 成功筛选出 2个新的cDNA序列 ,并获得其全长序列 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因. 方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源陛,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368. 结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt), 编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(humangene7transactivatedbynonstructuralprotein5AofhepatitisCvirus,HCVNS5ATP7)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP7后,有12条差异基因表达,其中4条基因表达增强,8条基因表达降低.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

5AT系列点火药热分解动力学及贮存期研究

采用热重分析法研究了受热条件下5AT系列点火药的热稳定性、分解动力学和贮存期。通过测定5AT系列点火药在氮气气氛中不同升温速率(β)下的TG–DTG热重曲线,分别使用Kissinger法、Ozawa法、Coats–Redfern法、寿命法4种方法进行动力学处理,获得热分解的表观活化能(Ea)、指前因子(A)以及热分解速率常数(k)等动力学参数。结果表明,Kissinge法所得Ea、A、k结果更为可靠,寿命法则可初步预估点火药的寿命。